本发明涉及天然药物提取
技术领域：
，尤其涉及以一种川榛有效提取成分及其在防治动脉粥样硬化中的应用。
背景技术：
：桦木科榛属植物榛子是用途非常广泛的一种植物，其内核坚果营养丰富，经济价值高，是主要的营养产品，富含高量的健康脂质，可以作为添加成分添加进巧克力、冰激凌等美食中，榛子作为食品很早就在我国历史上出现。榛子还具有丰富的医药疗效，具有健脾和胃，益肝明目的功效。主治病后体弱、食少疲乏、眼目昏花、久视无力、气血不足、小儿疳积等症。除内核外，榛子树的叶子也具有丰富的影响成分，其含有的粗蛋白质含量达到15％以上，粗纤维含量较高，可以作为动物饲料的营养成分使用，降低了饲料的生产成本，促进动物发育。除作为营养成分使用外，有研究发现，榛子树叶子还具有一定的治疗疾病的功效，民间医学用其治疗痔疮、静脉曲张、静脉炎、水肿等，榛子树叶片可以起到很好的功效，同时还具有抗微生物的功效，具有很强的药用价值。随着心脑血管疾病发病率逐年增高的势头，动脉粥样硬化已成为我国医学研究的重点和热点领域。众所周知，动脉粥样硬化是导致冠状动脉疾病发病和死亡的主要原因。其病因及发病机制极为复杂，它的发生发展基本上是按着脂质条纹-纤维斑块-粥样斑块-临床合并症出现等4个阶段进行。随着对中药有效成分抗动脉粥样硬化研究的不断深入，其机制的研究也日趋广泛，已深入到细胞及分子水平，其可通过多种机制防治动脉粥样硬化及其并发症。动脉粥样硬化发病机制复杂，中药对于复杂疾病，能从多途径、多环节、多靶点干预动脉粥样硬化病理过程，具有多靶点协同作用的优势和潜力。如丹参酮IIA为唇形科植物丹参的干燥根及根茎中的有效成分。研究表明，丹参酮IIA可以降低TC、TG、LDL-C及升高HDL-C，通过调节血脂水平来调控动脉粥样硬化；通过抑制相关的炎症因子等抑制炎性反应，抑制动脉粥样硬化的发生发展；抑制血小板的聚集，改善血流变相关指标，改善凝血纤溶系统，抑制血栓的形成，能从多途径、多环节、多靶点起到防治动脉粥样硬化及其并发症的作用。目前已经从榛子树叶子中提取出各种分类化合物，例如二芳基庚烷类化合物、紫杉烷类化合物，但是对这些物质的药用功效并没有进行深入的分析，本申请在现有研究的基础上，针对我国川榛(拉丁名CorylusheterophyllaFisch.exTrautv.var.sutchuenensisFranch.)经过大量的实验研究，获得最佳的提取方式，对川榛的有效成分进行了有效的提取和分离，并且发现其中一种化合物在血管保护方面功效显著，尤其在对疗动脉粥样硬化效果显著高于其他有效成分，未来可以应用于动脉粥样硬化的治疗。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是从川榛树叶中提取出天然提取药物药效成分，该成分可以提高SOD活性，降低MDA含量，具有抗氧化损伤的功效，同时，可以抑制血管壁NF-kappaB的蛋白表达，减轻血管壁炎症反应，从而具有防治动脉粥样硬化的功效。为解决上述技术问题，本发明提供一种用于防治动脉粥样硬化的药物活性成分，其结构式为：本发明还提供一种药物提取物在制备防治动脉粥样硬化的药物中的应用，所述药物提取物为4，6-二甲氧基-2-氧杂-三环[12.2.2.13，7]二十碳-1(18)，3(20)，4，6，8，10，15(19)，16-八烯-5(S)，12(S)，14-三醇，结构式如下：所述药物提取物是从川榛树叶中提取出来的。本发明还提供了一种从川榛树叶上提取出防治动脉粥样硬化的药效化合物的方法，其包括：第一步，取川榛树叶，放太阳光下晒至树叶变干，碾碎，放入萃取容器中，用石油醚浸泡，每隔半天搅拌，过滤，树叶备用；第二步，过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用氯仿萃取液浸泡，每隔半天搅拌，过滤，树叶备用；第三步，过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用甲醇萃取液浸泡，每隔半天搅拌，过滤，获得甲醇萃取液，旋蒸除去甲醇溶剂，粉碎，获得甲醇提取物；第四步，第三步获得的甲醇提取物再次放入萃取容器中，用乙酸乙酯和甲醇构成的混合萃取液浸泡，每隔半天搅拌，过滤，获得混合萃取液，备用；第五步，将第四步获得的混合萃取液旋蒸、真空干燥，获得乙酸乙酯和甲醇混合萃取溶剂获得的提取产物固体，上羟丙基葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20分离，采用甲醇冲洗，通过薄层色谱板监测冲洗的产物，获得分离产物；第六步，将第五步获得的分离产物分成若干批次，每次采用HPLC色谱分离，采用甲醇与水作为流动相，获得第一产物；第七步，改变流动相配比，甲醇与水作为流动相，获得作为药效成分的第二产物(结构式1)和第三产物；第八步，再次改变流动相配比，甲醇与水作为流动相，获得第四产物；第九步，再次改变流动相配比，甲醇与水作为流动相，获得第五产物；第十步，再次改变流动相配比，甲醇与水作为流动相，获得第六产物和第七产物。本发明还提供采用上述结构式1表示的化合物作为药物药效成分制备成的各种防治动脉粥样硬化的药物。其中，所述药物剂型优选为口服剂型或注射剂型。其中，药物剂型可以为片剂，颗粒剂，胶囊剂，丸剂，口服液，注射液。本发明还提供一种用于防治动脉粥样硬化的缓释胶囊，其包括上述结构式1表示的化合物作为药物活性成分以及载体和辅料。本发明的有益效果：本发明从川榛树叶中提取出天然提取药物药效成分，该成分可以提高SOD活性，降低MDA含量，具有抗氧化损伤的功效，同时，可以抑制血管壁NF-kappaB的蛋白表达，减轻血管壁炎症反应，从而具有防治动脉粥样硬化的功效。具体实施方式本发明从川榛树叶上提取出一种具有防治动脉粥样硬化的化合物，其结构为：本发明还提供了上述化合物的提取方法，其包括：第一步，取1.5kg的川榛树叶，放太阳光下晒至树叶变干，碾碎，放入萃取容器中，用石油醚3L浸泡2天，每隔半天搅拌2小时，过滤，树叶备用；第二步，过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用氯仿2.5L萃取液浸泡2天，每隔半天搅拌2小时，过滤，树叶备用；第三步，过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用甲醇2.5L萃取液浸泡3天，每隔半天搅拌2小时，过滤，获得甲醇萃取液，旋蒸除去甲醇溶剂，粉碎，获得甲醇提取物；第四步，第三步获得的甲醇提取物再次放入萃取容器中，用乙酸乙酯和甲醇按照体积比2∶1构成的混合萃取液3L浸泡3天，每隔半天搅拌2小时，过滤，获得混合萃取液，备用；第五步，将第四步获得的混合萃取液旋蒸、真空干燥，获得43g乙酸乙酯和甲醇混合萃取溶剂获得的提取产物固体用硅胶按照1∶1的比例混匀，上羟丙基葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20分离，采用甲醇冲洗，通过薄层色谱板监测冲洗的产物，获得分离产物25.3g；第六步，将第五步获得的分离产物分成若干批次，每次2g采用HPLC色谱分离，采用甲醇与水按照体积比2∶1的比例作为流动相，流速为2.5ml/min，获得第一产物；第七步，改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为4∶3，流速仍然为2.5ml/min，获得第二产物(结构式1)和第三产物(结构式2)；第八步，再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为1∶1，流速仍然为2.5ml/min，获得第四产物；第九步，再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为4∶5，流速仍然为2.5ml/min，获得第五产物；第十步，再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为2∶3，流速仍然为2.5ml/min，获得第六产物和第七产物。虽然世界范围内榛子属植物种类多样，但是榛子果实和榛子树叶中所含有的天然提取物的种类和结构千差万别，导致所采用的提取溶剂，提取步骤差异显著。本申请经过大量的萃取溶剂的对比筛选，针对川榛树叶通过前期石油醚、氯仿的萃取清洗，除去不需要的杂质部分，进一步通过甲醇提取获得本发明所需要的基础提取物，但这一基础提取物经过谱图检测还含有多种杂质成分，因此针对这一基础提取物采用混合萃取溶剂再次萃取，以分离出多余的杂质成分，通过多次实验及比对，发现采用乙酸乙酯和乙醇按照体积比2∶1，萃取效果最好。随后采用半自动高效液相色谱进行分离提取，获得六种产物，经药效学实验研究，发现第二产物(结构式1)在抗氧化损伤、生物因子表达方面具有很好的效果，为该类药物的防治动脉粥样硬化提供依据。本发明还提供采用上述结构式1表示的化合物作为药物药效成分制备成的各种防治动脉粥样硬化的药物，所述药物剂型优选为口服剂型或注射剂型，可以采用常规药物制备方法制备成的各种药物剂型，药物剂型可以为片剂，颗粒剂，胶囊剂，丸剂，口服液，注射液等，优选为胶囊剂。本发明还提供一种用于防治动脉粥样硬化的缓释胶囊，其包括上述结构式1表示的化合物作为药物活性成分以及载体和辅料。以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1川榛抗动脉粥样硬化有效成分的提取取1.5kg的川榛树叶，放太阳光下晒至树叶变干，碾碎，放入萃取容器中，用石油醚3L浸泡2天，每隔半天搅拌2小时，过滤，树叶备用；过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用氯仿2.5L萃取液浸泡2天，每隔半天搅拌2小时，过滤，树叶备用；过滤后的树叶再次放入萃取容器中，用甲醇2.5L萃取液浸泡3天，每隔半天搅拌2小时，过滤，获得甲醇萃取液，旋蒸除去甲醇溶剂，粉碎，获得甲醇提取物；获得的甲醇提取物再次放入萃取容器中，用乙酸乙酯和甲醇按照体积比2∶1构成的混合萃取液3L浸泡3天，每隔半天搅拌2小时，过滤，获得混合萃取液；将获得的混合萃取液旋蒸、真空干燥，获得43g乙酸乙酯和甲醇混合萃取溶剂获得的提取产物固体用硅胶按照1∶1的比例混匀，上羟丙基葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20分离，采用甲醇冲洗，通过薄层色谱板监测冲洗的产物，获得分离产物25.3g；将获得的分离产物分成若干批次，每次2g采用HPLC色谱分离，采用甲醇与水按照体积比2∶1的比例作为流动相，流速为2.5ml/min，获得第一产物，改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为4∶3，流速仍然为2.5ml/min，获得第二产物4，6-二甲氧基-2-氧杂-三环[12.2.2.13，7]二十碳-1(18)，3(20)，4，6，8，10，15(19)，16-八烯-5(S)，12(S)，14-三醇(结构式1)和第三产物4，6-二甲氧基-2-氧杂-三环[12.2.2.13，7]二十碳-1(18)，3(20)，4，6，8，10，15(19)，16-八烯-5(S)，12(R)，14-三醇(结构式2)，再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为1∶1，流速仍然为2.5ml/min，获得第四产物；再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为4∶5，流速仍然为2.5ml/min，获得第五产物；再次改变流动相配比，甲醇与水的体积比改为2∶3，流速仍然为2.5ml/min，获得第六产物和第七产物。最终25.3g分离产物经过半自动HPLC的分离提取，获得第一产物1.71g，第二产物1.33g，第三产物1.17g，第四产物0.82g，第五产物1.69g，第六产物1.20g，第七产物0.93g。式1所示第一产物采用CDCl3作为溶剂进行核磁分析。1HNMR(CD3OD，600MHz，δppm)：7.57(1H，dd)；7.65(1H，dd)；7.13(1H，dd)；7.01(1H，dd)；6.72(1H，d)；6.29(1H，dd)；6.06(1H，dd)；5.59(1H，dd)；5.10(1H，s)；5.09(1H，overlap)；3.99(3H，s)；4.03(1H，m)；3.61(3H，s)；2.23(1H，m)；1.70(1H，m)。式1所示化合物[α]D20+39.2(c＝0.15，在CH2Cl2)。式2所示第二产物采用CDCl3作为溶剂进行核磁分析。1HNMR(CD3OD，600MHz，δppm)：7.72(1H，dd)；7.35(1H，dd)；7.19(1H，dd)；6.99(1H，dd)；6.58(1H，d)；6.16(1H，dd)；5.79(1H，dd)；5.82(1H，dd)；5.10(1H，s)；5.01(1H，overlap)；3.95(3H，s)；4.03(1H，m)；3.63(3H，s)；2.19(1H，m)；1.75(1H，m)。式1所示化合物[α]D20-39.2(c＝0.15，在CH2Cl2)。药效学实验实验动物：SD雄性大鼠100只，体重220g～250g，清洁型，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，动物实验许可证号SXQ(鲁)2-006。实验药物：阿托伐他汀片(辉瑞制药有限公司，批号1239260)，实验前将药物按剂量比配制成混悬液0.25g/1kg；实施例1提取的药效成分化合物1和化合物2，将药物按剂量比配制成混悬液0.1g/1kg。试剂：TC、TG、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA测试盒购自青岛嘉诚生物试剂公司。分组和模型：100只SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组、对照1组和对照2组，每组20只。造模方法，饲喂基础饲料的大鼠常规观察一周，随机分5组：正常组、模型组、治疗组、对照1组和对照2组。除正常组给与基础饲料外，其余各组饲喂高脂饲料(配方：1％胆固醇+35％胆酸+5％炼制猪油+0.1％丙硫氧嘧啶及基础饲料)的大鼠按70万单位VitD3/kg的总计量分3天腹腔注射，对照组同时给予等体积的生理盐水腹腔注射，连续观察20天，造模成功。给药方法造模成功后，正常组和模型组：每天灌胃蒸馏水(1ml/100g)；试验组，每天灌胃化合物1药效成分0.1g/kg悬混液；对照1组，每天灌胃化合物2药效成分0.1g/kg悬混液；对照2组，每天灌胃阿托伐他汀片0.25g/1kg悬混液，再观察8周。血脂检测实验结束后大鼠断头取血，低温离心，3000rpm；15分钟分离血清，血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)采用酶法；丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸比色法；超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法。一氧化氮(NO)采用硝酸还原法；内皮素(ET)采用放射免疫法。免疫组化法检测：NF-kappaB蛋白表达按试剂盒说明操作。免疫组化采用PV法染色。光镜下观察结果，胞浆染色呈棕黄色表示阳性。图像分析：每组动物随机选取8例免疫组化切片，置显微镜下观察，每张切片选择阳性目标最多的区域采取5个视野，由摄像系统提取细胞图像，输入HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统，计算阳性目标的100％含量和阴性目标100％含量，最后计算出阳性细胞占所有细胞的100％含量，即阳性细胞率。统计学方法应用SPSS16.0统计学软件进行计算分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。结果大鼠血清NO、ET的影响，结果见表1。表1大鼠NO、ET的变化组别药物剂量N0(μmol/L)ET(ng/L)正常组-60.13±5.23**173.92±10.11**模型组-31.86±5.01201.30±11.81试验组0.1g/kg51.26±5.70**168.51±9.35**对照1组0.1g/kg33.90±4.95190.21±12.17对照2组0.25g/kg41.89±5.03*169.38±10.69**与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01从表1可以看出，模型组血清NO水平较对照组显著降低，ET水平明显升高；试验组、对照2组与模型组比较NO水平升高，ET降低有显著性差异；进一步，本发明提取出的化合物1在改善大鼠NO、ET方面与西药阿托伐他汀片具有类似的功效，甚至效果更好，可以更为显著提高NO水平，而异构体化合物2则完全没有体现出相关功效，其相较于模型组变化不大。大鼠SOD、MDA的影响，结果见表2。表2大鼠SOD、MDA的变化组别药物剂量SOD(nu/ml)MDA(μmol/L)正常组-539±63**4.91±0.83**模型组-367±496.33±1.01试验组0.1g/kg493±56**5.36±1.05**对照1组0.1g/kg375±516.17±0.99对照2组0.25g/kg486±61**5.91±0.82*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01从表2可以看出，模型组血清SOD活力较对照组明显降低，MDA含量明显升高；试验组、对照2组较模型组SOD水平明显升高，MDA含量降低，有显著性差异。进一步本发明提取出的化合物1在改善大鼠SOD、MDA方面与西药阿托伐他汀片具有类似的功效，尤其在MDA改善甚至效果更好，而异构体化合物2则完全没有体现出相关功效，其相较于模型组变化不大。通常，SOD活性下降、MDA含量升高，表明动脉粥样硬化时氧化损伤加重，而氧化损伤刺激了血管壁NF-kappaB的蛋白表达，从而使得NF-kappaB的阳性细胞率升高，显示NF-kappaB的激活与氧化应激密切相关。大鼠对血管壁NF-KappaB表达的影响，结果见表3。表3免疫组化检测NF-KappaB阳性细胞率结果组别nDAI评分正常组-3.61±0.89**模型组-46.23±5.03试验组0.1g/kg11.73±1.92**对照1组0.1g/kg41.93±2.01对照2组0.25g/kg25.39±4.69*与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01正常组未发现任何变化，模型组早期血管内皮细胞、平滑肌细胞及泡沫细胞胞浆内呈强阳性表达(++)，病变晚期结构破坏阳性表达减弱，血管壁胞浆中阳性细胞比例显著高于对照组。治疗组血管内皮细胞、平滑肌细胞及泡沫细胞胞浆内呈弱阳性表达(±)，血管壁胞浆中阳性细胞比例显著低于模型组，对照1组和模型组情况基本相同，对照2组血管内皮细胞、平滑肌细胞及泡沫细胞胞浆内呈阳性表达(+)，较模型组减弱，但是并没有治疗组减弱的明显，血管壁胞浆中阳性细胞比例显著低于模型组。通过试验可以看出，结构式1表示的化合物可以提高SOD活性，降低MDA含量，具有抗氧化损伤的功效，同时，可以抑制血管壁NF-kappaB的蛋白表达，减轻血管壁炎症反应，从而具有防治动脉粥样硬化的功效。所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。当前第1页1 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