本发明属于生物领域，具体涉及一种厌氧真菌及用其发酵小麦秸秆生产乙醇的方法。
背景技术：
能源短缺和环境危机是制约当今世界经济社会发展的两大主要问题。世界各国在努力提高现有能源利用效率的同时，积极寻求新能源出路。生物质能源是当今世界上仅次于煤炭、石油和天然气的第四大能源，在世界能源总消费量中占14％左右。生物质能源以其可再生、资源丰富、价廉环保而逐渐成为一种重要的新的替代能源。农作物秸秆是生物质能源的重要组成部分，蕴藏着巨大的养分，是重要的能源和资源，也是一种重要的可再生性生物资源。按热值计2吨秸秆约相当于1吨标准煤，故被称为是永不枯竭的能源，如何让农作物秸秆能源发挥最大效益，已成为全世界广泛关注的问题。据Smith(1984)统计，农作物秸秆在世界上的产量每年大约有20-30亿吨。其中小麦秸占21％，稻草19％，大麦秸10％，玉米秸35％，谷草5％，高粱秸5％。中国是农业大国，秸秆资源类型十分丰富，分布广泛，种类繁多，我国农作物秸秆年总产量达5.5-5.7亿多吨，列世界之首，主要秸秆类型是小麦，玉米和水稻等粮食作物。秸秆资源的开发利用，既可缓解农村肥料、饲料、能源和工业原料的紧张状况，又可保护农村生态环境、促进农村经济可持续协调发展，但目前我国农村的大量秸秆资源完全处于高消耗、高污染、低利用率、低产出状况，没有得到合理开发利用，畜牧业能量饲料资源紧缺严重，解决人畜争粮，提高饲料利用率，开发利用新的饲料资源，解决能源问题已成为亟待解决的问题。随着石油、煤炭等不可再生资源的日益减少，综合利用农作物秸秆这种宝贵的可再生资源资源对于节约资源、保护环境、促进农业可持续发展具有重要意义。
Orpin 1975年首次证实瘤胃内有厌氧真菌存在时，厌氧真菌降解纤维素的能力引起了重视。反刍动物和草食动物胃肠道中的瘤胃厌氧真菌是重要的纤维降解菌之一。由于厌氧真菌菌丝具有穿透植物厚壁组织的物理降解作用以及产生一系列高活性的降解植物细胞壁的纤维素降解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和酯 酶等多种木质纤维素降解酶的化学降解作用，被认为在瘤胃的木质化组织的降解中发挥重要作用。
厌氧真菌可以利用的底物包括可溶性糖，如葡萄糖、果糖、纤维二糖、龙胆二糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等，以及纤维素、木聚糖、葡聚糖等复杂的结构性多糖，储存还有淀粉和糖原等贮存性多糖等。Neocallimastix属菌株利用的多糖种类最多，Caecomyces属对底物的利用种类最少，同属厌氧真菌的的不同菌株对各种糖类的利用能力也不一样。
现有秸秆发酵生产乙醇的方法以玉米秸秆为载体制备固定化酵母细胞并用于餐厨废弃物发酵生产乙醇的方法，需要单独加入糖化酶和淀粉酶，相应增加了成本。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种厌氧真菌。
本发明的另一个目的是提供用上述厌氧真菌发酵小麦秸秆生产乙醇的方法，以解决现有方法存在的乙醇产量低且成本高的问题。
本发明技术方案如下：一种厌氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF,CGMCC NO:13392，具有大量产乙醇的能力。
用上述厌氧真菌发酵小麦秸秆生产乙醇的方法，包括如下步骤：以小麦秸秆为底物，以厌氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF纯培养为接种物，同时加入复合抗生素和配制好的氯霉素，于39℃温度下厌氧培养7天，所产乙醇浓度为260.0mM。
优选地，所述复合抗生素为1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素。
优选地，厌氧培养7天后，对厌氧瓶内发酵液在10000×g 4℃条件下离心5min收集上清测定乙醇产量。
优选地，所述秸秆只需粉碎风干，不需要给秸秆去皮。
本发明厌氧真菌(Piromyces sp.)Yak TZF,CGMCC NO:13392，已经于2016年12月23日在中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(北京)保藏,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院生物研究所。
干草、树叶、秸秆、秕壳等这类粗饲料，是反刍动物的重要营养来源，占反刍动物日粮的40％-80％，粗饲料中的纤维素经过瘤胃微生物发酵形成挥发酸、二氧化碳及甲烷等产物，是反刍动物的主要能源物质。秸秆的主要成分是木质纤 维素，包括纤维素、半纤维素和木质素等，这些物质很难被动物消化利用。提高秸秆的利用效率，开发秸秆为成纤维素含量低、蛋白质含量高，营养丰富、成本低、消化率高、适口性好达到变费为宝的目的具有重要的生态效益和战略意义，建立高效生物转化技术是解决我国巨大秸秆资源的根本出路。实现纤维素的生物转化一个有效途径就是利用高效纤维酶降解木质纤维素为小分子有机物。
厌氧真菌对底物的降解能力与菌株种属、底物种类、培养方法、分离动物的饲料和动物的地域分布都有关系，同属不同菌株的降解能力也不同。一般认为Neocallimastix属和Piromyces属降解秸秆的能力较强。
反刍动物瘤胃是一个天然独特的消化发酵罐，对粗纤维显著的降解能力为世界瞩目，这源于瘤胃内存在大量能够降解纤维素的微生物。我国牦牛饲养主要以放牧为主，放牧条件下牦牛所采食的低质牧草细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素构成。牦牛瘤胃微生物高效协同降解野牧草为牦牛提供营养，使牦牛瘤胃成为高效降解木质纤维素的天然发酵罐。
本发明特点在于：1.用本发明的厌氧真菌降解小麦秸秆产乙醇的方法的生产工艺更加简便，主要是厌氧环境的保证。2.本发明方法对秸秆只需粉碎风干，不需要给秸秆去皮。3.本发明方法所产乙醇浓度很高，在50mL的厌氧发酵瓶中接种5mL厌氧真菌降解小麦秸秆，到第7天所产乙醇浓度为260.0mM。
具体实施方式
下面对本发明做进一步详细的说明。
1.牦牛瘤胃厌氧真菌的分离和鉴定
1.1材料
1.1.1采样地点概况与牦牛瘤胃液的采集
研究地点位于甘肃省天祝藏族自治县乌鞘岭牧场(102°47′13″E，37°10′37″N)，年均温-1-1.3℃，最高气温26℃，最低气温-30℃，年降水量265-632mm，海拔3100-3400m，属寒冷高原气候类型，温度变化剧烈，日照强，雨量充沛，植物生长期约120天，高寒草甸是主要草地类型。野生牧草包括羊茅、苔草、早熟禾、嵩草、藏嵩草、细叶嵩草、棘豆、金露梅、珠芽寥，珠芽蓼(Polygonum viviparum)和线叶嵩草(Kobresia capillifolia)是该地区的主要优势物种。
2012年春季3月以采食天然牧草，无补饲的全放牧天祝白牦牛中的20头健 康公牦牛(阉牛，年龄4-5岁，体重250±50kg)为实验动物。用不锈钢胃管一头通过开口器插入瘤胃，另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出，迅速用无菌注射器分别吸取1mL瘤胃食糜液接种到9mL厌氧真菌液体培养基中，并置39℃恒温培养。
1.1.2厌氧真菌培养基
基本培养基：参考Bauchop(1979)培养基做改进。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4gK2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
分离纯化培养基：在液体基本厌氧培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆。
琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L琼脂粉，
秸秆培养基：在液体基本培养基中添加以粉碎的小麦秸秆、玉米秸秆或水稻秸秆为底物的液体培养基，添加量为1％(w/v)。
传代培养基：在液体基本培养基中添加1％(w/v)的小麦秸秆。
培养基分装到亨氏厌氧管或厌氧瓶中，厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO2的抽气装置进行培养基除氧。首先真空泵抽出管中气体达到负压时培养基颜色改变，然后充入高纯CO2。每管抽气充气3次，其中第一次约15min，其余二次每次5min，最后一次充气后用无菌株针再放气使得厌氧管内外压平衡，并于121℃高温高压湿热灭菌20min备用。
复合抗生素：医用青霉素钠0.48g(80万单位)与医用硫酸链霉素1g(100万单位)溶解于5mL液体培养基中，使得青霉素和硫酸链霉素的终浓度分别达到1600IU/mL和2000IU/mL。(消除细菌)。
氯霉素溶液：60mg氯霉素溶解于3mL乙醇(以无菌水为溶质，浓度50％(v/v)的乙醇)，使其浓度达到20mg/mL。厌氧真菌传代时每次添加25uL到10mL反应体系，使其在培养基中的终浓度为50μg/mL。(消除甲烷菌)。
1.2方法
1.2.1厌氧真菌的选育
采用亨盖特滚管技术选育真菌及甲烷菌共培养物。用无菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜样品，接种到39℃预热的9mL液体基本培养基中，即制成10-1稀释液，再取稀释液依次梯度稀释至10-2、10-3，1mL稀释液被接种到亨盖特厌氧管，厌氧管内有9mL液体基本培养基、葡萄糖(1g/L)和融化的琼脂(20g/L)。接种的同时，每管液体培养基中用七号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴，同时再添加配好的20mg/mL氯霉素溶液到亨氏厌氧管的10mL反应体系中，被接种的厌氧管立即在冰上滚管后放置39℃培养4天。真菌单菌在接种后2-3天长出，在厌氧条件下，用接种环挑取单菌接种到无秸秆的，添加葡萄糖(1g/L)的液体基本培养基中，接种的同时，每管液体培养基中用7号注射针头无菌注射器加入复合抗生素溶液2滴，同时再添加配好的氯霉素溶液到亨氏厌氧管的10mL反应体系中。这个过程在亨盖特琼脂滚管和葡萄糖液体培养基之间重复4-5次，直到亨盖特琼脂滚管上的真菌菌落镜检后形态一致，即获得了真菌单菌。将获得的单菌接种于小麦秸秆培养基中，39℃培养，每4天传代1次，每次传代时加入复合抗生素溶液。
厌氧真菌的传代：传代时用无菌注射器吸取1mL共培养物到厌氧管中的9mL小麦秸秆培养基，4天传代1次。
1.2.2厌氧真菌形态学鉴定
用普通光学显微镜观察固体琼脂管培养基中培养2-3天的厌氧真菌菌体形态、假根、菌丝、孢子囊和孢子梗，用相差显微镜(BX41-PHD-P11，上海，中国)观察真菌在无秸秆，添加葡萄糖为底物的液体培养基中培养2-3天的厌氧真菌菌体形态、孢子囊、孢子梗、假根、菌丝体和游动孢子鞭毛及运动状态，根据形态学特征对其做出种属鉴定。
1.2.3厌氧真菌分子生物学鉴定
1.2.3.1厌氧真菌总DNA的提取
采用液氮研磨菌体后使用天根植物基因组试剂盒(天根生化科技，北京)提取厌氧真菌总DNA。
(1)10mL厌氧真菌及甲烷菌共培养物菌液接种到90mL，无秸秆，添加0.1％(w/v)葡萄糖的液体培养基中培养4-5天后将菌液移到离心管后12000×g离心5min，弃上清，收集菌体沉淀转入研钵，加入液氮将菌体快速充分研磨成粉末。
(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％(w/v)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000×g离心5min。
(4)将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2。
(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000×g离心30s，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。
(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)重复操作步骤(7)。
(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CB3转入干净的离心管，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000×g离心2min，将溶液收集到离心管中。
(11)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3，室温放置2min，12000×g离心2min。
(12)DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
1.2.3.2厌氧真菌ITS1序列的PCR扩增
利用厌氧真菌ITS1专用引物Neo18S For(5’-AAT CCT TCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)扩增厌氧真菌的ITS1全序列(Edwards等，2008)。使用MyCycler PCR仪(Bio-rad，美国)进行扩增，PCR反应缓冲液(总体积10μL)包括40mM Tricine-KOH(pH 8.0),16mM KCI，3.5mM MgC12，100μg/mL牛血清白蛋白，800μM dNTP，500nM上下游引物，0.2μL 50×TITANIUM Taq酶和模板DNA大约50ng。PCR反应条件是：95℃5min，然后10个循环95℃30s，68℃30s(每个循环降1℃)和72℃30s，然后25个循环95℃30s，58℃30s和72℃30s，最后72℃延伸6min。没有模板的PCR反应体系作为空白对照。
1.2.4厌氧真菌的进化关系分析
厌氧真菌ITS1序列测序结果提交NCBI，在NCBI数据库中通过BLAST比对分析，采用ClustalX V1.83对序列做多序列的全部比对，获得进化树最终序列，使用MEGA6.0(Tamura等，2013)软件的neighbor-joining法构建系统进化树。
1.3试验结果
1.3.1牦牛瘤胃厌氧真菌的分离纯化和鉴定
从天祝牦牛瘤胃液中分离纯化5个厌氧真菌。细菌特定引物968f/1401r扩增显示每一个共培养中都没有细菌污染。5个厌氧真菌接种于亨氏厌氧管中小麦秸秆培养基，4天传代1次以保证其活性。光学显微镜、相差显微镜下观察真菌形态，基于厌氧真菌的形态学鉴定和ITS1序列分析，得到本发明产乙醇最好的株厌氧真菌是：Piromyces Yak TZF。
2.牦牛瘤胃厌氧真菌降解秸秆功效及其产乙醇研究
2.1材料
基本培养基：参考Bauchop(1979)培养基做改进。酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO37.0g，刃天青(1.0g/L)1mL，L-半胱氨酸盐酸盐1.7g，晨饲前采集瘤胃液8000×g，4℃离心20min后的上清170mL，盐溶液I 165mL，盐溶液II 165mL，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液I包括NaCl 6g，(NH4)2SO4 3g，KH2PO4 3g，CaCl2·2H2O 0.4g，MgSO4·2H2O 0.6g，蒸馏水定容至1000mL。
盐溶液II包括4gK2HPO4，蒸馏水定容至1000mL。
传代培养基：厌氧管传代。液体基本培养基中不加葡萄糖，以粉碎的小麦秸秆1％(w/v)为底物。
秸秆培养基：在100mL厌氧瓶中加入45mL液体基本培养基，不加葡萄糖，以粉碎的500mg小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆作为底物。
目标菌株：5株厌氧真菌纯培养中因为菌株Piromyces Yak TZF生长最快，底物小麦秸秆因为真菌Piromyces Yak TZF的生长利用产气而最早浮起，因此以厌氧真菌Piromyces Yak TZF作为目标菌株。
2.2方法
以瘤胃厌氧真菌纯培养Piromyces Yak TZF为目标菌株，每1个培养物在小麦秸秆为底物的厌氧管中传代培养，传代培养同时用无菌注射器分别接种5mL 培养物到以500mg小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物的45mL液体厌氧培养基中，测定7天培养期内真菌纯培养Piromyces Yak TZF降解3种秸秆底物的功效，包括：总产气量、木质纤维素降解酶活性、干物质降解率、中性洗涤纤维素降解率和乙醇产量。
2.2.1实验设计和取样
分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物，以真菌纯培养Piromyces Yak TZF为接种物。每1个培养物加入每1种秸秆为底物做3个平行。5mL培养物被接种到45mL秸秆为底物的液体培养基中，同时加入复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)和配制好的氯霉素，39℃厌氧培养7天。隔24h取出培养物的3个平行厌氧瓶，厌氧瓶内发酵液5000×g 4℃离心10min收集上清测定木聚糖酶(Xylanase)、羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPase)、阿魏酸酯酶(FAE)、乙酰酯酶(AE)、香豆酸酯酶(CAE)的活性，进一步10000×g4℃离心5min收集上清测定乙醇产量。厌氧瓶内残留底物秸秆量用来测定干物质降解率(IVDMD)、中性洗涤纤维降解率(NDFD)。不接种培养物的液体秸秆培养基作为空白对照。
2.2.2秸秆基本营养成分测定
所用底物为小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆。干物质(DM)根据AOAC的方法进行测定，(1999，ID 930.5)。粗蛋白通过凯氏定氮仪(Foss Electric，丹麦)进行测定(AOAC，1999，ID 948.13)。灰分(ID 942.05)、钙(ID 927.02)和磷(ID965.17)参照AOAC的方法进行(1999)。中性洗涤纤维(NDF)和参照Van Soest等(1991)的方法进行。在NDF测定中没有使用α-淀粉酶，使用了亚硫酸钠，NDF测定值中包含着残渣灰分。
2.2.3厌氧真菌降解秸秆的产气量测定
接种共培养物于厌氧管后接AGRS-1型体外产气自动记录装置和软件系统(国家发明专利授权号ZL200610011301.X)测定实时产气量。
2.2.4厌氧真菌降解秸秆的酶活测定
将共培养物的发酵液1000×g 4℃离心10min，取上清液测定酶活性。采用分光光度计用DNS法测定木聚糖酶、羧甲基纤维素酶和滤纸酶活性，用酶标仪测定阿魏酸酯酶和乙酰酯酶活性。
2.2.5.1木聚糖酶(Xylanase)活性的测定
稀释的粗酶液(稀释至OD值大约在0.2-0.8范围)、底物10g/L桦木木聚糖(SigmaX-0502)和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μL DNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物羧甲基纤维素钠中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
2.2.5.2羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的测定
稀释的粗酶液、底物10g/L羧甲基纤维素钠和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μLDNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据葡萄糖标曲计算CMCase酶活。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物羧甲基纤维素钠中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
2.2.5.3滤纸酶(FPase)活性的测定
稀释的粗酶液,底物1×6cm Whatmen No.1滤纸和50mM磷酸钠缓冲(pH 6.8)置39℃预热15min，750μL粗酶液中加入750μL磷酸钠缓冲液和500μL底物，39℃反应15min后，加入3000μLDNS终止反应。沸水浴5min后冷却至室温，取2000μL于比色皿中，在540nm下检测吸光值。根据葡萄糖的标曲计算FPase酶活。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物Whatmen No.1滤纸中释放1μmol葡萄糖所需的酶量。
DNS溶液：准确称取10.0g 3,5-二硝基水杨酸(分析纯)，转移至1000mL烧杯中，加入500mL蒸馏水，放到磁力搅拌器上，将加热温度调到45℃，边加热边搅拌。然后加入10.0g氢氧化钠，直至溶液清澈透明。然后逐步加入四水酒石酸钾钠208g，苯酚2.0g，无水亚硫酸钠0.5g。继续45℃加热，同时补加约300mL蒸馏水，直至加入的药品完全溶解。将溶液冷却，定容至1000mL，然后用烧结玻璃过滤器(测定粗纤维用过滤器)过滤后，将滤液转移至棕色瓶中，避光于冰箱保存一周后备用，有效期为6个月。
2.2.5.4阿魏酸酯酶(FAE)活性的测定
稀释粗酶液并置39℃预热15min，含100μM阿魏酸甲酯(Sigma Chemicals)的100mM 3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)溶液(pH 6.8)作为底物置39℃预热15min。在100μL粗酶液中加入200μL底物，39℃反应30min，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在340nm下检测反应0min和30min时的吸光值，根据阿魏酸及阿魏酸甲酯标准曲线计算阿魏酸酯酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物阿魏酸甲酯中释放1μmol阿魏酸所需的酶量。
100mM MOPS缓冲液(pH 6.8)：称取5.2323g MOPS，溶于150mL去离子水中，用NaOH调pH至6.8，用去离子水定容至250mL。
2.2.5.5乙酰酯酶(AE)活性的测定
稀释粗酶液并置39℃预热15min，2mM对-硝基苯乙酯作为底物和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.8)置于39℃预热15min。向50μL粗酶液中加入100μL磷酸钠缓冲液和50μL底物，39℃反应30min后，用酶标仪(680XR，Bio-rad，美国)在415nm下检测吸光值，根据对-硝基苯的标准曲线计算乙酰酯酶活性。
1个酶活力单位(U)是指在以上所述酶促反应条件下，1mL酶液在1min内自标准底物对-硝基苯乙酯中释放1μmol对-硝基苯所需的酶量。
2.2.6厌氧真菌降解秸秆纤维降解率测定
2.2.6.1干物质降解率测定
采用尼龙袋法。
2.2.6.2中性洗涤纤维降解率测定
中性洗涤纤维(NDF)按照Van Soest等(1991)的方法进行，测定如下：
(1)中性洗涤剂的配制
称取37.22g乙二胺四乙酸二钠(Na2EDT，化学纯)和13.62g四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)同放入第一个1000mL烧杯中，加少量水加热溶解后，再加入60g十二烷基硫酸钠和20mL乙二醇乙醚。称取9.3g无水磷酸氢二钠(相当于25.2g十二水磷酸氢二钠)，置于另一烧杯中，加少量水，微微加热溶解后倾于第一个烧杯中，定容至2000mL。此溶液pH在6.9-7.0左右(一般不需调整)。注意：由于十二烷基硫酸钠是起泡剂，所以在溶解时先将其他试剂放入烧 杯中用蒸馏水加热溶解，边加热溶解边加入十二烷基硫酸钠。
(2)滤袋和样品的准备
将待测秸秆样品烘干后过40目和60目筛(大于60目小于40目)。用2B铅笔给滤袋编号，置于105℃烘箱中烘干，称重(m1)。
(3)称样
称取制备好的秸秆样品(m)于滤袋中。
(4)封口
在距离滤袋上边缘大约5mm用封口机封口。将样品在滤袋中展均匀分布。(5)空白对照
至少取一个空白滤袋(C1)C1为空白袋子校正系数(烘干后质量m3/原来质量m0)，同时做空白测定。
(6)消煮
将滤袋放入消煮器(200-300mL高型烧杯，上盖表面皿)中，将煮沸的中性洗涤剂溶液按照1个样品100mL的量加入，按1个样品0.5g的量加入无水亚硫酸钠，适量热稳定α-淀粉酶(17400单位/mL，1个活性单位表示能将1mg可溶性淀粉用30min水解)，然后将上述溶液加入消煮器中。大约1.8L中性洗涤剂煮24个样，边加热边搅拌，加热并维持溶液温度100℃，处理时间75min，包括加热升温时间。每隔10min用粗玻棒在烧杯内壁挤出滤袋中溶液，并轻微搅动使中性洗涤剂再次进入袋内充分作用于样品。在沸腾时，保持微沸煮1h。保证消煮过程中洗涤剂浓度不变。
(7)淋洗
消煮结束，停止加热和搅拌，取出滤袋，轻轻挤干多余溶液，加2000mL预先加热好的(85-90℃)去离子水，重复2次，共淋洗3次。
(8)丙酮处理
最后一次淋洗后，将滤袋从滤袋支架上取下来，轻轻挤压去掉多余的水。然后将滤袋放入250mL烧杯中，加丙酮至覆没滤袋，浸泡3-5min，然后取出并轻轻挤压去掉多余的丙酮。)
(9)烘干
在通风橱中展开滤袋，让其自然干燥。完全干燥后放入105℃烘箱烘干6h， 在丙酮完全挥发掉之前不能把滤袋放入烘箱中。
(10)称重
从烘箱中取出滤袋，直接放入干燥器中冷却至室温，然后称重(m2)。
(11)中性洗涤纤维(NDF)计算
试样中中性洗涤纤维(中性洗涤纤维主要包括半纤维素、纤维素、木质素和灰分)质量分数按以下公式计算：
NDF(％)＝(m2—(m1×C1))×100/m
m1：为空袋质量(g)。
m：为样品质量(g，DM)。
m2：为提取处理后样品残渣+滤袋质量(g，DM)。
C1：为空白袋子校正系数(烘干后质量m3/原来质量m0)。
(12)中性洗涤纤维降解率(NDFD)计算
未接种培养物的NDF作为起始NDF。NDFD(％)＝[(起始NDF﹣剩余NDF)/起始NDF]×100。
2.2.7厌氧真菌降解秸秆产乙醇量的测定
样品处理将发酵后的样品在7000r/min转速离心5min，得上清液，再将上清液抽真空过0.45μm微孔滤膜，置冰箱备用。取待测样品10mL于50mL容量瓶中，甲醇定容，再将待测定液在3000r/min下离心10min后过0.45μm有机滤膜，备用。甲醇为样品的稀释剂。正丙醇作为乙醇定量分析的内标物。乙醇(色谱纯，CAS：64-17-5，西陇化工股份有限公司)，甲醇(色谱纯，CAS：67-56-1，北京化工厂)，正丙醇(色谱纯，CAS71-23-8，天津市津科精细化工研究所)。
气相色谱仪(Agilent 7890A)，FID检测器(美国AGILENT公司)，Chemstation化学工作站，7683B自动进样器(美国AGILENT公司)，AG-1602型空气泵(北京科普生分析科技有限公司)，HG-1803型高纯氢气发生器(北京科普生分析科技有限公司)。色谱条件为：色谱柱HP-INNOWAX毛细管柱(30m×0.25mm×25μm)，FID检测器温度220℃，氢气流速40mL/min，空气流速400mL/min，尾吹(N2)流速30mL/min，进样口温度200℃，分流比为20∶1，柱流速为1mL/min，柱温平衡时间0.5min，程序升温60℃(保持1min)，以10℃/min升至120℃(保持1min)，进样量1μL。该测定方法的乙醇回收率在97.3-107.1％之间，重复性实 验的相对标准偏差(RSD)为4.11％。
2.3试验结果
2.3.1厌氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸秆产气量
真菌Piromyces Yak TZF以小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物的总产气量分别为：150mL/g DM，180mL/g DM和163mL/g DM。
2.3.2厌氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸秆酶活
真菌Piromyces Yak TZF以小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物的木聚糖酶分别为：4100mU,3980mU和3510mU,滤纸酶活分别为：151.5mU,131.0mU,和90.5mU,阿魏酸酯酶分别为：9.1mU,5.5mU和4.0mU,乙酰酯酶分别为：108.0mU,99.7mU和92.0mU,香豆酸酯酶分别为：0.35mU,0.38mU和0.39mU。
2.3.3厌氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸秆的纤维降解率
真菌Piromyces Yak TZF以小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物的干物质降解率IVDMD为：62.1％,67.7％和65.3％。真菌Piromyces YakTZ以小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆为底物的中性洗涤纤维降解率为：40.3％，44.1％和46.8％
2.3.4厌氧真菌Piromyces Yak TZF降解秸秆所产乙醇量
真菌纯培养Piromyces Yak TZF降解3种秸秆(小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆)产生大量代谢产物，包括氢气，乙酸，乳酸和乙醇，其中所产乙醇量尤为突出，明显高于目前厌氧真菌产乙醇量的报道，而且产量达到近年工业生产乙醇的工业用菌株所产乙醇量，见下表1(真菌纯培养Piromyces Yak TZF降解秸秆产生乙醇量的测定)。
表1
注：a，b，c，d表示统计学差异性(p<0.05)。
总结以上实验表明：来自天祝放牧牦牛瘤胃真菌真菌纯培养Piromyces Yak TZF是高效降解秸秆者，降解秸秆的同时能够有效转化廉价木质纤维素—秸秆产生大量乙醇，以小麦秸秆为底物在7天培养期内产生最高乙醇浓度达到260.3mM，高于所有以前厌氧真菌产乙醇量的报道，并达到工业产菌株生产乙醇量，证明了天祝放牧牦牛瘤胃纯培养真菌菌株PiromycesYak TZF高效降解小麦秸秆的同时能够转化秸秆为大量乙醇的显著优势和重要的工业生产乙醇的应用前景。