一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法与流程

文档序号:12411826阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法,其特征在于具体包括以下步骤:

(1)材料的培养:

把培养至成体的材料用灭菌的海水洗刷3次,然后用吸水纸吸干材料,称量储存待用,每次实验需要5g材料。

2.(2)分离细胞核:

①取5g材料在液氮中用研钵和研杵研磨,然后迅速地移动至50ml预冷的1xHB缓冲液中;在4℃孵育30分钟,每隔5分钟轻轻搅拌;

②将提取液用500目筛绢过滤以除去未消化的组织;

③选用10μm的网格,通过过滤除去细胞碎片;

④将滤液分装到离心管中,然后在2000g/min、4℃条件下离心20分钟;

⑤离心完以后弃上清,然后再次加入1xHB缓冲液清洗细胞核至无色,细胞核悬浮在750μl的1xHB缓冲液中;

⑥用等体积的1.4%低熔点琼脂糖包埋分离的细胞核;

⑦将形成的胶块放在4℃孵育1小时;

⑧然后用20倍体积的含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液在65℃条件下裂解切成条的胶块,裂解时间48小时;

⑨去除裂解缓冲液,加入20ml的1mol/L的EDTANa2去除裂解液中的蛋白酶;

⑩最后将胶块保存在0.5M的EDTANa2中待用;

(3)利用脉冲场电泳分离细胞核DNA和细胞器DNA:

①制备一块1%的琼脂糖凝胶,将包埋的含有细胞核的胶块填充在点样孔;

②设置脉冲场电泳的分离条件为:分离片段的范围大小为100-1000kb,电压为120V,转角60°,分离12小时,在凝胶成像系统中观察电泳结果;

③将细胞核和细胞器DNA条带分别切下来,利用低熔点琼脂糖酶消化胶条,回收DNA,即为细胞核DNA和细胞器DNA。

3.根据权利要求1所述的一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法,其特征在于所述分离细胞核过程中的裂解缓冲液为:含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液。

根据权利要求1所述的一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法,其特征在于所述步骤(2)中第⑧步中的胶块裂解温度为:50℃。

4.根据权利要求1所述的一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法,其特征在于所述步骤(3)中第③步中的低熔点琼脂糖酶的酶活为1000U/ml,工作浓度为 200μl凝胶块红加入2U低熔点琼脂糖酶,消化温度为60℃,消化时间为 60min。

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