一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法与流程

本发明涉及一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，属于生物工程领域。

背景技术：

藻类是一个多样性较高的生物类群，在整个群体中占据着非常重要的位置，而且在整个生命类群中属于比较古老的类群。随着分子生物学的发展，藻类的基因组学的研究将有助于我们更加清晰的了解藻类的独特之处，获得更加丰富的基因信息，从而来揭示其神秘的机制。过去几年中，随着高通量技术的成熟及成本的下降，藻类基因组（核基因组和细胞器基因组）已经取得了较大的突破，这些研究成果不仅有助于帮助我们了解藻类一些特殊的性状和分子机制，而且有助于加强我们对藻类乃至光合生物的起源和进化的认识；此外，现在很多学者致力于利用分子生物学的技术来进行优良藻种的选育，从基因组信息来探索一条适合藻类分子育种的新途径，进而提高优良藻种的选育速度。因此，建立藻类基因组对揭示其生命原理及促进藻类产业发展具有深远意义。

目前由于新一代高通量测序技术的迅猛发展，很多非模式生物的全基因组测序工作开始进行或者已经完成，摆脱了以往非模式生物遗传背景匮乏的现象。作为海洋低等物种的藻类，尽管已有一些藻类的基因组工作完成，但相对于高等植物而言，对其基因组的研究数量还是相当匮乏的；这是由于藻类DNA中多糖、多酚、高拷贝质体和线粒体DNA的存在，制约了藻类核基因组测序工作的进展。所以首先获得高质量和高分子量的藻类核DNA是进行相关工作的第一步，也是所有工作的前提条件。

对于藻类物种来说，由于其在生长过程中会产生多酚、多糖等次级代谢产物，增加了DNA提取的难度。随着对藻类的进一步研究，发现在藻类的总DNA中存在着高拷贝的质体和线粒体DNA，这就意味着在实验过程中只可以得到核DNA占很少比例的DNA，如果用这种DNA来进行高通量测序，不仅会增加测序的成本，而且会降低我们对于藻类基因组信息了解的准确性，很难利用生物信息学手段将细胞核DNA和细胞器DNA分离开，成为目前藻类DNA相关工作的瓶颈因素。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，实现通过生物信息学手段分离获得高质量的核DNA和细胞器DNA，主要流程包括材料的培养，分离细胞核，利用脉冲场电泳分分离核DNA和细胞器DNA，利用荧光定量技术检测质体、线粒体和核DNA中的含量，利用高通量测序技术检测质体、线粒体和核DNA的含量。该方法有效解决了藻类DNA中细胞核DNA和细胞器DNA的分离难题及藻类DNA提取过程中多糖多酚干扰现象，具有分离DNA纯度高、操作精准度高、成本低等优势，对促进藻类基因学发展及藻类优良藻种的选育具有重要意义。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，具体包括以下步骤：

（1）材料的培养：

把培养至成体的材料用灭菌的海水洗刷3次，然后用吸水纸吸干材料，称量储存待用，每次实验需要5g材料。

（2）分离细胞核：

①取5g材料在液氮中用研钵和研杵研磨，然后迅速地移动至50ml预冷的1xHB缓冲液中；在4℃孵育30分钟，每隔5分钟轻轻搅拌；

②将提取液用500目筛绢过滤以除去未消化的组织；

③选用10μm的网格，通过过滤除去细胞碎片；

④将滤液分装到离心管中，然后在2000g/min、4℃条件下离心20分钟；

⑤离心完以后弃上清，然后再次加入1xHB缓冲液清洗细胞核至无色，细胞核悬浮在750μl的1xHB缓冲液中；

⑥用等体积的1.4%低熔点琼脂糖包埋分离的细胞核；

⑦将形成的胶块放在4℃孵育1小时；

⑧然后用20倍体积的含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液在65℃条件下裂解切成条的胶块，裂解时间48小时；

⑨去除裂解缓冲液，加入20ml的1mol/L的EDTANa₂去除裂解液中的蛋白酶；

⑩最后将胶块保存在0.5M的EDTANa₂中待用；

（3）利用脉冲场电泳分离细胞核DNA和细胞器DNA：

①制备一块1%的琼脂糖凝胶，将包埋的含有细胞核的胶块填充在点样孔；

②设置脉冲场电泳的分离条件为:分离片段的范围大小为100-1000kb，电压为120，转角60°，分离12小时，在凝胶成像系统中观察电泳结果；

③将细胞核和细胞器DNA条带分别切下来，利用低熔点琼脂糖酶消化胶条，回收DNA，即为细胞核DNA和细胞器DNA。

本发明提供一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，其特征在于所述分离细胞核过程中的裂解缓冲液为：含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa₂和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液。

上述步骤（2）中第⑧步中的胶块裂解温度为：50℃。

上述步骤（3）中第③步中的低熔点琼脂糖酶的酶活为 1000U/ml,工作浓度为 200μl凝胶块红加入2U低熔点琼脂糖酶，消化温度为60℃，消化时间为 60min。

本发明提供一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，实现通过脉冲电泳分离获得高质量的核DNA和细胞器DNA，突破了传统通过超高速离心获取质体DNA的技术手段，提高了质体DNA的纯度，不但降低DNA分离成本，也有效解决了藻类DNA中细胞核DNA和细胞器DNA的分离难题及藻类DNA提取过程中多糖多酚干扰现象，获取了更加全面的基因组信息，具有分离DNA纯度高、操作精准度高、成本低等优势，对促进藻类基因学发展及藻类优良藻种的选育具有重要意义。

附图说明

图1为脉冲场电泳图谱，其中图中第一条带为细胞核DNA，弥散为细胞器DNA；

图2为利用荧光定量技术计算核DNA、质体DNA和线粒体DNA的比例图，其中左图为CTAB法分离后的DNA比例图，中图为脉冲分离法核DNA条带图，右图为脉冲分离法细胞器DNA比例图；

图3为利用测序技术计算核DNA、质体DNA和线粒体DNA的比例图，其中左图为CTAB法分离后的DNA比例图，右图为脉冲分离法DNA条带图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述领域技术人员应能理解，所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。

实施例1本发明分离细胞核和细胞器DNA的方法

一种藻类高质量细胞核和细胞器DNA的分离方法，具体包括以下步骤：

（1）材料的培养：

把培养至成体的材料用灭菌的海水洗刷3次，然后用吸水纸吸干材料，称量储存待用，每次实验需要5g材料。

（2）分离细胞核：

①取5g材料在液氮中用研钵和研杵研磨，然后迅速地移动至50ml预冷的1xHB缓冲液中；在4℃孵育30分钟，每隔5分钟轻轻搅拌；

②将提取液用500目筛绢过滤以除去未消化的组织；

③选用10μm的网格，通过过滤除去细胞碎片；

④将滤液分装到离心管中，然后在2000g/min、4℃条件下离心20分钟；

⑤离心完以后弃上清，然后再次加入1xHB缓冲液清洗细胞核至无色，细胞核悬浮在750μl的1xHB缓冲液中；

⑥用等体积的1.4%低熔点琼脂糖包埋分离的细胞核；

⑦将形成的胶块放在4℃孵育1小时；

⑧然后用20倍体积的含1%十二烷基磺酸钠、0.5MEDTANa2和1mg/ml蛋白酶K的裂解缓冲液在65℃条件下裂解切成条的胶块，裂解时间48小时；

⑨去除裂解缓冲液，加入20ml的1mol/L的EDTANa₂去除裂解液中的蛋白酶；

⑩最后将胶块保存在0.5mol/L的EDTANa₂中待用；

（3）利用脉冲场电泳分离细胞核DNA和细胞器DNA：

①制备一块1%的琼脂糖凝胶，将包埋的含有细胞核的胶块填充在点样孔；

②设置脉冲场电泳的分离条件为:分离片段的范围大小为100-1000kb，电压为120，转角60°，分离12小时，在凝胶成像系统中观察电泳结果；

③将细胞核和细胞器DNA条带分别切下来，利用低熔点琼脂糖酶消化胶条，回收DNA，即为细胞核DNA和细胞器DNA；

④纯度测定：经过纯度的测定，DNA溶液中的多糖含量也急剧减少，溶液不再粘稠，A260/280的值在1.7-1.9左右；

（4）利用荧光定量技术检测细胞核和细胞器DNA中不同DNA成分的含量

为了进一步验证细胞器DNA降低的效果，我们先根据已知的数据库，选取核、质体、线粒体上的单拷贝基因，然后根据Primer5设计引物，构建标准质粒，绘制标准曲线；同时用CTAB法提取了正常培养的材料的DNA作为对照；以紫菜为例，选取了脂氧合酶（5'CAGGACAAGGAGTCGGAGGA3'，5'CAGAGCCAATGCGAAAGG3'）、rbcL（5'GCAAGAAATGAAGGTCGT3'，5'TCAGCTGTGTCTGTGGAA3'）和cob（5'ACCAATGATTCCGATAAG3'，5'GAGGTGTCCGTCGTAAAG3'）基因，扩增效率分别为91%、97%、95%；

①用Nanodrop2000定量，然后把这三种DNA按照梯度进行稀释，并用稀释的DNA进行荧光定量实验，按照(gE(gCt))/(cpE(cpCt))或(gE(gCt))/(mtE(mtCt))和([{#cpDNA的拷贝数}/倍性*质体基因组的大小]/1C基因组大小)*100公式来计算核基因、质体基因、线粒体基因的比例；

②根据绝对定量的结果，我们可以看到在用CTAB法提取的总DNA中，核DNA只占21%，质体的比例为76%，线粒体的比例为3%；而在用脉冲分离的核DNA中，核DNA的比例增加到了71%，质体的比例22.7%，线粒体的比例为6.3%；细胞器DNA的条带中，质体的比例增加到了87.9%，线粒体增加到6.7%，核DNA的比例为5.4%；

（5）利用高通量测序技术检测质体和线粒体DNA在总DNA和核DNA中的含量

为了进一步确证细胞器DNA减少的效果，将用CTAB法提取的DNA和脉冲分离法提取的DNA构建基因组文库，利用高通量测序进行进一步验证。用脉冲场电泳分离的总DNA中，核DNA的比例也高达81%；

上述验证试验结果表明，通过本发明技术方案，可以很好的分离细胞DNA和细胞器DNA。