本发明涉及提取原油总脱氧核糖核酸(DNA)的试剂盒及其方法，属于微生物地质学技术领域。
背景技术：
从油藏环境中高效提取总DNA是应用分子生物学方法研究油藏微生物多样性的前提和基础，样品DNA质量是后续分子生物学实验成败的关键因素。无论是新开发或开发中的油藏(分别简称为新油藏和旧油藏)，采出液样品包括原油、油水混合物、地层水和固体物质，大多是油水混合物。我国现阶段新油藏不多，大多数已经是开发中后期旧油藏，不同驱油作业方式导致采出液产生大量悬浮物，致使样品很难进行过滤分离。特别是原油属于复杂体系，由数目众多的烃类和非烃类化合物组成(a.杜卫东，万云洋，钟宁宁等.土壤和沉积物石油污染现状[J].武汉大学学报(理学版).2011(04):311-322；b.Du W,Wan Y,Zhong N,et al.Status quo of soil petroleum contamination and evolution of bioremediation[J].Petroleum Science.2011,8(4):502-514.)，不能在水中充分扩散，导致原油中的微生物不能与水充分混合，长期以来无人关注，甚至认为微生物不可能存在于原油中，并且不同类型的原油密度差异大，这些特点都给DNA高效提取带来相当大的难度。目前，对于新旧油藏原油样品总DNA的提取，国内外还未形成一套通用的提取纯化方法体系，因此，本领域亟需构建一套在油藏领域通用的纯化体系。
技术实现要素：
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供提取原油总脱氧核糖核酸的方法和试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供提取原油总脱氧核糖核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对原油预处理；
(2)采用阳-阴表活剂法裂解经预处理后的原油中活细胞和/或死细胞得含总脱氧核糖核酸的上清液；
(3)利用氯仿-醇沉淀、苯酚/氯仿-醇沉淀、氯仿-纯化柱及苯酚/氯仿-纯化柱4种纯化方法之一从所述上清液中提取得到总脱氧核糖核酸。
本发明还可根据上述方法开发出4种提取原油总脱氧核糖核酸的试剂盒。
本发明针对原油自身性质和成分复杂的特点，开发了一种适用范围广的提取原油中总DNA的方法和试剂盒，其通过阳-阴表活剂法可减少DNA损失，利用4种纯化方式中任一种可增加朊和盐类等的去除，既提高了提取液中DNA的浓度又提高了纯度。
根据本发明的具体实施方案，在本发明所述的方法中，所述的对原油预处理包括以异辛烷和/或乙二胺四乙酸(TE)缓冲液对原油进行预处理。
根据本发明的具体实施方案，在本发明所述的方法中，所述的预处理包括在原油中加入等体积异辛烷和/TE缓冲液，再加入适量玻璃珠，涡旋，充分研磨成匀浆，装入离心管后离心，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀，并放入冰箱内备用。
本发明TE缓冲液可按下列方法配制：首先配制50mL 1mol/L pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，称取Tris 6.06g，加超纯水溶解并定容至50mL；然后配制50mL 0.5mol/L pH 8.0Na2EDTA：称取Na2·2H2O 9.306g，加超纯水溶解并定容至50mL；最后将1mL 1mol/L pH 8.0的Tris-HCl和0.2mL 0.5mol/L pH Na2EDTA混合，超纯水定容至100mL，最终配制成1倍TE缓冲液(10mmol/L pH 8.0Tris-HCl；1mmol/L pH 8.0Na2EDTA)。
优选地，所述原油包括轻质原油、中质原油、重质原油、特重质原油。
本发明所述轻质原油是指的原油，或20℃时密度≤0.852g/cm3的原油。
本发明所述中质原油是指在0.8654～0.9340之间的原油，或20℃时密度在0.852～0.930g/cm3之间的原油。
本发明所述重质原油是指在0.9340～1之间的原油，或20℃时密度0.931～0.998g/cm3之间的原油。
本发明所述特重质原油是指的原油，或20℃时密度在0.931～0.998g/cm3之间的原油。
本发明
根据本发明的具体实施方案，在本发明所述的方法中，当所述原油为轻质原油时，采用异辛烷和/或TE缓冲液进行预处理；当所述原油为中质原油、重质原油或特重质原油时，采用异辛烷进行预处理。
所述的阳-阴表活剂裂解活和死细胞法包括如下步骤：在步骤(1)预处理后的样品中加入质量体积比1g:20～40μL的浓度为10～20mg/mL溶菌酶，振荡，加入质量体积比为1g:2～4mL的浓度为5～20mg/mL的含十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的DNA提取缓冲液，及质量体积比为1g:20～40μL的浓度为5～20mg/mL朊酶k，振荡，再加入质量体积比为1g:0.2～0.4mL的浓度为100～200mg/mL的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，样品加热至50～65℃维持1h～2h，冷却至20～25℃后离心收集上清液；所述质量体积比均是相对于所述预处理后的样品。
优选地，所述含CTAB的DNA提取缓冲液含有Tris-HCl、Na2EDTA、NaCl及CTAB；还可含有Na3PO4；进一步优选地，该DNA提取缓冲液含50～200mmol/L pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、50～200mmol/L pH8.0的Na2EDTA，50～200mmol/L pH 8.0的Na3PO4、0.5～2mol/L NaCl及浓度为5～20mg/mL的CTAB。
本发明所述Tris-HCl溶液可按下列方法配制：称取12.1g Tris，加800mL超纯水充分搅拌溶解，再加入盐酸调节pH为8，再加入超纯水定容至1L。
优选地，所述离心是在6000～8000rpm离心10～20min。
根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的方法中的4种纯化方法中采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊，其包括的步骤如下：将步骤(2)中所得上清液与等体积的所述含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂混合，10～30℃(如20～25℃)条件下，离心去除含朊沉淀；优选地，所述含氯仿的有机溶剂为体积比为24～26：0.5～1.5的氯仿与异戊醇的混合溶剂。所述含苯酚/氯仿的有机溶剂为体积比为24～26：23～25：0.5～1.5的苯酚、氯仿与异戊醇的混合溶剂。
根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的方法中，在除去步骤(2)中朊后，氯仿-醇沉淀或苯酚/氯仿-醇沉淀纯化方法还包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊的上清液至等体积的异丙醇或两倍体积无水乙醇中，充分混匀放入4℃冰箱8～12h，离心后弃去上清，并加入预冷的70％乙醇洗涤4～5次，在空气中充分干燥后加入50～200μL灭菌超纯水，涡旋混匀。
根据本发明的具体实施方式，在本发明所述的方法中，在除去步骤(2)中朊后，氯仿-纯化柱或苯酚/氯仿-纯化柱纯化方法还包括：移取采用含氯仿或苯酚/氯仿的有机溶剂除去步骤(2)中朊的上清液至核酸纯化柱中，用THE洗液1～2次清洗，静止5～10min，确保所述核酸纯化柱中膜彻底干燥，加入50～200μL灭菌超纯水，混匀后洗提DNA。
优选地所述核酸纯化柱是以硅胶膜作为核酸的特异性吸附材料的，主要特点是对其他生物材料基本不吸附，可以保障最大程度地回收样品中的DNA，同时去除其他杂质。
优选地所述THE洗液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和乙醇的混合溶液，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与乙醇的体积比为10～15：27～32。
本发明方法突出的特点是健全了原油样品从预处理到纯化整个过程的方法体系，增加裂解效果，提高了DNA的产量和纯度，针对中质原油、重质原油、特重原油及轻质原油总DNA提取提供了高效的提取方案。
另一方面，本发明提供了提取原油总脱氧核糖核酸试剂盒，其包括：
溶菌酶溶液、含CTAB的DNA提取液、SDS、朊酶k溶液、氯仿/异戊醇、异丙醇及乙醇(试剂盒1)；或
溶菌酶溶液、含CTAB的DNA提取液、SDS、朊酶k溶液、苯酚/氯仿/异戊醇、异丙醇及乙醇(试剂盒2)；或
溶菌酶溶液、含CTAB的DNA提取液、SDS、朊酶k溶液、氯仿/异戊醇、THE洗液及核酸纯化柱(试剂盒3)；或
溶菌酶溶液、含CTAB的DNA提取液、SDS、朊酶k溶液、苯酚/氯仿/异戊醇、THE洗液及核酸纯化柱(试剂盒4)。
本发明所述试剂盒包括：溶菌酶、含十六烷基三甲基溴化铵的DNA提取缓冲液、十二烷基硫酸钠、朊酶k、氯仿/异戊醇、苯酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、乙醇、THE洗液及核酸纯化柱。
优选地，前述试剂盒中各试剂各自独立地为：
溶菌酶的浓度为10～20mg/mL；含CTAB的DNA提取缓冲液浓度为5～20mg/mL的；SDS的浓度为100～200mg/mL；朊酶k的浓度为5～20mg/mL；氯仿/异戊醇的体积比为24～26：0.5～1.5；苯酚/氯仿/异戊醇的体积比为24～26：23～25：0.5～1.5。
优选地，所述含CTAB的DNA提取缓冲液含有Tris-HCl、Na2EDTA、NaCl及CTAB；还可含有Na3PO4；进一步优选地，该DNA提取缓冲液含50～200mmol/L pH8.0的Tris-HCl、50～200mmol/L pH8.0的Na2EDTA，0.5～2mol/L NaCl，浓度为5～20mg/mL的CTAB及50～200mmol/L pH 8.0的Na3PO4。
优选地所述THE洗液为Tris-HCl溶液和乙醇的混合溶液，优选地，所述Tris-HCl溶液与乙醇的体积比为10～15：27～32。
根据本发明的具体实施方式，前述试剂盒还包括异辛烷和/或TE缓冲液。
本发明试剂盒中各物质的量可根据实际情况确定，例如溶菌酶溶液为2～10mL；含CTAB的DNA提取缓冲液为200～1000mL；SDS溶液为20～100mL；朊酶k溶液为2～10mL；核酸纯化柱和收集管各为50～100个。
采用以上试剂盒可方便的应用本发明所述的方法，以达到高效提取原油中总脱氧核糖核酸的目的。
综上可知，本发明提供了一种提取原油总脱氧核糖核酸的方法及试剂盒，其针对原油自身性质和成分复杂的特点，开发了一种适用范围广的提取原油中总DNA的方法，其通过阳-阴表活剂法可减少DNA损失，同时增加对朊的去除，氯仿-纯化柱法可增加对盐类等的去除，既提高了提取液中DNA的浓度又提高了纯度。
附图说明
图1为本发明预处理方法+阳-阴表活剂法裂解活细胞和死细胞+4种纯化方法提取总DNA的电泳图谱。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
以下实施例或对比例中，采用以下手段验证DNA提取效果：
利用核酸朊检测仪测定DNA提取液浓度和纯度，其中，纯度用OD260/OD280来表示。
实施例中所有涉及到的原油样品均采至辽河油田，L2YJC226、L2YHC23、L2YHC02及L3YSD14，密度分别为0.9105g/cm3、0.9686g/cm3、0.953g/cm3及1g/cm3，粘度分别为50.11mPa·s、2639mPa·s、1595.1mPa·s及340800mPa·s，分别属于中质原油、重质原油、重质原油及特重质原油。
实施例1
取100mg L2YHC23重质原油样品，利用异辛烷进行预处理，利用阳-阴表活剂法裂解活细胞和/或死细胞，利用4种方法进行纯化，分别为氯仿-醇沉淀法、苯酚/氯仿-醇沉淀法、苯酚/氯仿-纯化柱法及氯仿-纯化柱法。
本实施例预处理的方法：向L2YHC23油样中加入等体积异辛烷和适量的玻璃珠，涡旋20min，充分研磨成匀浆。装入离心管后离心(8000rpm，20℃，20min)，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀。
本实施例阳-阴表活剂法裂解活细胞和/或死细胞法：称取预处理后样品5g于离心管中，加入150μL的浓度为20mg/mL的溶菌酶，振荡，加入15mL浓度为10mg/mL的含CTAB的DNA提取缓冲液，及150μL的浓度为10mg/mL朊酶k，振荡，再加入1.5mL浓度为200mg/mL的SDS溶液，样品加热至65℃维持2h，冷却至20～25℃后离心收集上清液；所述离心是在8000rpm离心20min，收集上清，转移到新的离心管中。
本实施纯化方法分为以下4种：
(a)氯仿-醇沉淀法：将细胞裂解后离心得到的上清液与等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合，充分混匀后8000rpm离心20min，去除朊；吸取氯仿抽提后的上清液至新离心管，加入等体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，充分混匀放入4℃冰箱12h，8000rpm离心20min，弃上清并加入预冷的70％乙醇洗涤4～5次，空气中充分干燥后加入100μL灭菌超纯水，涡旋混匀。
(b)苯酚/氯仿-醇沉淀法：将实施例1(a)中的氯仿/异戊醇(24:1)更换成苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，其余过程与1(a)完全一致。
(c)氯仿-纯化柱法，将细胞裂解后离心得到的上清液与等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合，待充分混匀后，在室温条件，8000rpm离心20min，去除含朊沉淀。转移600μL氯仿/异戊醇抽提后的上清液至核酸纯化柱中，用THE洗液1～2次清洗，静止5～10min，确保纯化柱中膜彻底干燥。最后加入100μL灭菌超纯水，涡旋混匀后洗提DNA。其中的THE洗液为Tris-HCl和乙醇的混合液(13mL Tris-HCl对应30mL乙醇)。
(d)苯酚/氯仿-纯化柱法，其是将实施例1(c)中的氯仿/异戊醇(24:1)更换成苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，其余过程与1(c)完全一致。
DNA提取效果如表1所示：
表1实施例1所得提取液的DNA浓度及纯度
检测结果见表1，应用本发明方法均可有效提取原油总DNA，见图1，其中图中1为原油采用异辛烷预处理+阳-阴表活剂法+氯仿醇沉淀法所得结果；2为原油采用异辛烷预处理+阳-阴表活剂法+苯酚/氯仿醇沉淀法所得；3为原油采用异辛烷预处理+阳-阴表活剂法+氯仿纯化柱法所得结果；4为原油采用异辛烷预处理+阳-阴表活剂法+苯酚/氯仿纯化柱法所得结果；图中M为DL2000分子量标记。从表中及图中可看出4种方式均能获得好的结果，尤其是采用氯仿-纯化柱法，所得DNA浓度和纯度高，A260/A280比值达到1.82。
实施例2
与实施例1相比，实施例2将前处理方更换为TE法，取10mg L2YHC23原油样品并用TE进行预处理，裂解过程与实施例1完全一致，纯化方法也分为(a)氯仿-醇沉淀法、(b)苯酚/氯仿-醇沉淀法、(c)氯仿-纯化柱法、(d)苯酚/氯仿-纯化柱法，纯化过程与实施例1程完全一致。
本实施例预处理的方法具体步骤：向L2YHC23原油样品中加入10mL TE和适量的玻璃珠，涡旋10～20min，充分研磨成匀浆。装入离心管后离心(8000rpm，20℃，20min)，弃去上清液，保留离心管底部的沉淀。
DNA提取效果如表2所示：
表2实施例2所得提取液的DNA浓度及纯度
检测结果见表2，将前处理更换TE法后，仍可有效提取原油总DNA，见图1，图1中5为原油采用TE预处理+阳-阴表活剂法+氯仿醇沉淀法所得结果；6为原油采用TE预处理+阳-阴表活剂法+苯酚/氯仿醇沉淀法所得结果；7为原油采用TE预处理+阳-阴表活剂法+氯仿纯化柱法所得结果；8为原油采用TE预处理+阳-阴表活剂法+苯酚/氯仿纯化柱法所得结果；图中M为DL2000分子量标记。从表中及图中可以看出4种方式均能获得好的结果，尤其是采用氯仿-纯化柱法，所得DNA浓度和纯度最高。对比实施例1与实施例2的结果可以看出，TE处理法也是一种很有效的方法，可在轻质原油的DNA提取中应用。此外，原油用异辛烷处理所用样品量大，用TE处理样品量为前者的1/10，在稀油领域可广泛的应用。
实施例3
取100mg L2YJC226中质原油样品，用异辛烷进行预处理，利用阳-阴表活剂法+氯仿-醇沉淀法提取原油总DNA，操作流程和方法与实例1完全一致。
DNA提取效果如表3所示：
表3实施例3提取液DNA的浓度以及纯度
检测结果见表3，应用本发明阳-阴表活剂法+氯仿-醇沉淀法可有效提取原油总DNA。
对比例1
取100mg L2YJC226中质原油样品，用异辛烷进行预处理，利用反复冻融法+氯仿-醇沉淀法提取原油总DNA，与实施例3相比，仅更换了裂解方法，其余操作完全一致。
反复冻融法：称取前处理后样品5g于离心管中，加入15mL浓度为85mg/mL的生理盐水，离心管置于-80℃冰箱1h后放入微波炉中高火60s，反复三次，待温度降至20～25℃，8000rpm离心20min，收集上清，转移到新的离心管中。
氯仿-醇沉淀法：操作同实施例1(a)；
DNA提取效果如表4所示：
表4对比例1提取液DNA的浓度以及纯度
检测结果见表4，对比例1中裂解方式更换成反复冻融法后，原油总DNA提取的浓度和纯度比本发明方法(实施例3)效率低。
实施例4
取100mg L2YHC02重质原油样品，用异辛烷进行预处理，利用阳-阴表活剂法和氯仿-纯化柱法提取原油总DNA，操作流程和方法与实例1完全一致。
DNA提取效果如表5所示：
表5实施例4提取DNA的浓度以及纯度
检测结果见表5，应用本发明方法均可有效提取原油总DNA，证明本发明所述方法对于其他重质原油样品也有较好的应用。
对比例2
取100mg L2YHC02原油样品并用异辛烷按实施例1中的方式进行预处理，利用市场上商业化QIAGEN试剂盒提取原油总DNA。
细胞裂解过程按照QIAGEN试剂盒(mericonTM Food Kit)说明书进行，具体步骤：
1、取2g匀质样品放入50mL离心管中，添加10mL裂解缓冲液和25μL朊酶k缓冲液，短暂涡旋确保样品与裂解液混匀。
2、60℃震动温育30min，然后放在冰上冷却至20～25℃，保证抑制剂沉淀。
3、2500×g离心5min。
4、移取500μL氯仿到2mL离心管中。
5、从步骤3中移取700μL的上清液到含有氯仿的离心管中。
6、第5步的样品涡旋15s，14000×g离心15min。
7、吸取350μLPB缓冲液到一个新的2mL离心管，添加第6步350μL上层水相，涡旋混匀。
8、移取第8步上清液体600μL至QIAGEN核酸纯化柱中，17900×g离心1min，掉弃去收集管中悬出液。
9、用THE洗液1～2次清洗。
10、静止10min，晾干。
11、转移纯化柱到1.5mL离心管中，吸取100μL灭菌超纯水，涡旋混匀后洗提DNA。
表6对比例2提取DNA的浓度以及纯度
检测结果见表6，QIAGEN试剂盒法提取原油总DNA的浓度和纯度比本发明方法(实施例4)效率低。
实施例5
取100mg L3YSD14特重质原油样品，用异辛烷进行预处理，利用阳-阴表活剂法和氯仿-纯化柱法提取原油总DNA，操作流程和方法与实例1完全一致。
DNA提取效果如表7所示：
表7实施例5提取DNA的浓度以及纯度
检测结果见表7，应用本发明方法均可有效提取原油总DNA，证明本发明所述方法对于其他特重质原油样品也有较好的应用。
对比例3
取100mg L3YSD14原油样品并用异辛烷按实施例1中的方式进行预处理，利用对比例2中QIAGEN试剂盒法进行总DNA提取。
DNA提取效果如表8所示：
表8对比例3提取DNA的浓度以及纯度
检测结果见表8，QIAGEN试剂盒法提取原油总DNA的浓度和纯度比本发明方法(实施例5)低。
以上实施例对本发明的产品及方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的主要步骤及实施方式进行了阐述，上述实施例只是帮助理解本发明的方法及核心原理。对于本领域的技术人员，依据本发明的核心原理，在具体实施中会对各条件和参数根据需要而变动，综上所述，本说明书不应理解为对本发明的限制。