一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒与流程

本发明涉及DAN提取领域，尤其涉及一种鱼肠道微生物宏基因组文库构建总DNA的提取方法及试剂盒。

背景技术：

目前传统的微生物研究手段只能培养0.1％～1％的环境微生物，这将无法整体分析和利用微生物群落的构成和功能。宏基因组文库技术可以避开对微生物纯培养的限制，直接从环境中获得DNA分子，通过测序或者文库筛选，为人类进一步利用微生物资源提供了重要手段。DNA的提取与纯化是宏基因组文库构建的第一步，也是最关键的一步。

鱼肠道微生物具有非常重要的研究价值，可以用于研究鱼类健康和营养代谢、获得新型酶制剂等。常规DNA提取主要参照粪便DNA提取法。但是由于在文库构建过程中获得高纯度和高质量的DNA，应尽量避免鱼类体表微生物、鱼类肠道组织和食物的污染，同时还要避免鱼类消化道消化液对DNA的降解。因而，常规DNA提取方法满足不了鱼肠道微生物宏基因组文库构建的要求。所以，现有技术有待于更进一步的改进和发展。

技术实现要素：

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供的一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，在节约成本的前提下，提取高纯度DNA。

为解决上述技术问题，本发明方案包括：

一种用于鱼肠道微生物宏基因组总DNA提取方法的试剂盒，其包括：

溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；

溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L异硫氰酸胍，0.1％Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巯基乙醇，pH 8.5；

溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；

溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；

溶液E：50％Tris-HCl饱和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％异戊醇；

溶液F：96％氯仿,4％异戊醇；

溶液G：异丙醇；

溶液H：70％乙醇。

使用所述试剂盒之鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法，其包括以下步骤：

步骤一，将新鲜的样品鱼击昏，用吸水纸吸干样品鱼体表液体，用75％的酒精擦拭样品鱼体表面，置于-20℃冰箱内进行冷冻15-30分钟；

步骤二，使用溶液A配制琼脂糖凝胶溶液，在保温箱内使其平衡到65℃；

步骤三，迅速取出上述步骤一得到的样品鱼，使用步骤二得到的琼脂糖凝胶溶液涂渍样品鱼体表，对样品鱼体表微生物进行固定；冷却后使用灭菌手术剪迅速对鱼体进行解剖，分离得到鱼肠道；

步骤四，使用无菌过滤器吸取对应量的溶液B缓慢注入上述步骤三得到的鱼肠道，重复洗脱3次，将冲洗得到的鱼肠道内容物收集得到鱼肠道内容物溶液；

步骤五，将上述步骤四得到的鱼肠道内容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩涡震荡10-15分钟，得到悬浊液；

步骤六，将8层80目尼龙网纱置于布氏漏斗上，抽滤上述步骤五得到的悬浊液，使用对应量的溶液B清洗沉淀物，并收集滤液；

步骤七，将步骤六所得的滤液在10000rpm条件下离心10分钟并收集沉淀，然后用溶液C重悬沉淀，重复3次，得到下菌体沉淀备用；

步骤八，使用溶液A配置浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶，平衡其温度到45℃；将步骤七得到的菌体沉淀预热到45℃后，向其中加入该1％的低熔点琼脂糖凝胶，混合均匀后注入模具，并在4℃下凝固12小时，得到凝胶；

步骤九，将步骤八得到的凝胶浸入溶液D中，37℃下恒温震荡清洗12小时；

步骤十，将清洗后的凝胶放入低熔点琼脂糖电泳槽中，使用1％的低熔点琼脂糖凝胶进行封闭，在60v条件下电泳10分钟，并在紫外灯下迅速切下琼脂，得到琼脂糖凝胶；

步骤十一，将步骤十切下的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液A后，加热到65℃融化，并立即加入等体积溶液E，摇晃混匀，在12000rpm条件下离心5分钟，得到水相；

步骤十二，将步骤十一得到的水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入相同体积的溶液F，在12000rpm条件下离心5分钟，得到相应水相，

步骤十三，将步骤十二得到的相应水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍体积预冷溶液G，在-80℃条件下静置沉淀12小时，然后在进行10000rpm条件下离心10分钟；然后向其中加入少量的溶液H重复洗涤2次，得到DNA沉淀；

步骤十四，将步骤十三得到的DNA沉淀在室温下进行干燥，去除酒精对实验结果的影响，然后加入相应量的溶液A溶解得到相应DNA。

本发明提供的一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，有效避免了宿主、宿主体表微生物、食物组织DNA的污染，得到的DNA片段没有RNA、蛋白质、多糖、酚类等物质的污染，简化了后期实验的处理，DNA分子链的完整性比常规方法显著提升。所获得的DNA可满足宏基因组文库构建、宏基因组文库测序、PCR分析等实验要求。

附图说明

图1为本发明中提取的小黄鱼肠道微生物总DNA的电泳图；

图2为本发明中使用试剂盒进行16S-rRNA基因PCR扩增的电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法及试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供了一种用于鱼肠道微生物宏基因组总DNA提取方法的试剂盒，其包括：

溶液A：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，pH 8.0；

溶液B：100mM/L Tris-HCl，20mM/L EDTA,100mM/L NaCl，0.1g/L PVP，100mM/L异硫氰酸胍，0.1％(v/v)Triton-X100，0.1mM PMSF，1％(v/v)β-巯基乙醇，pH 8.5；

溶液C：100mM/L Tris-HCl，1mM/L EDTA，0.9％NaCl，5mM/L DTT，pH 8.0；

溶液D：50mg/ml蛋白酶K，20mg/ml溶菌酶，100mM/L Tris-HCl，100mM/L NaCl，0.1％SDS，pH 8.0；

溶液E：50％Tris-HCl饱和酚(pH 8.0),48％氯仿,2％异戊醇；

溶液F：96％氯仿,4％异戊醇；

溶液G：异丙醇；

溶液H：70％乙醇。

其更为具体的是：

溶液A为Tris、EDTA的混合溶液，混合溶液中Tris浓度为100mM/L，EDTA浓度为1mM/L，用盐酸调整pH到8.0。

溶液B为Tris、EDTA、NaCl、PVP、异硫氰酸胍、PMSF、β-巯基乙醇的混合溶液，混合溶液中Tris浓度为100mM/L，EDTA浓度为20mM/L,NaCl浓度为100mM/L,PVP浓度为0.1g/L，异硫氰酸胍浓度为100mM/L，PMSF浓度为100mM/L，Triton-X100浓度为0.1％(v/v)，β-巯基乙醇浓度为1％(v/v)，用盐酸调整pH到8.5。

溶液C为Tris、EDTA、NaCl的混合溶液。混合溶液中Tris浓度为100mM/L，EDTA浓度为1mM/L，NaCl浓度为0.9％，DTT浓度为5mM/L，用盐酸调整pH到8.0。

溶液D为蛋白酶K、溶菌酶、Tris、NaCl、SDS的混合溶液，其中蛋白酶K浓度为50mg/mL，溶菌酶浓度为20mg/mL，Tris100mM/L，NaCl浓度为100mM/L，SDS浓度为0.1％，用盐酸调整pH到8.0。

溶液E为Tris饱和酚(pH 8.0)、氯仿和异戊醇混合溶液。Tris饱和酚(pH 8.0)体积分数为50％,氯仿体积分数为48％,异戊醇体积分数为2％。

溶液F为氯仿异戊醇混合溶液,氯仿体积分数为96％,异戊醇体积分数为4％。溶液G为异丙醇，溶液H为70％乙醇水溶液。

其具体的作用如下：溶液A用于配置琼脂糖凝胶溶液，在此环境下，微生物DNA可以保持稳定。溶液B用于鱼肠道内容物的冲洗和收集，该试剂可以灭活或抑制DNA酶、蛋白酶等酶的活性，降低内容物中细菌菌体的降解。溶液C用于稀释引起肠道微生物细胞裂解和DNA水解的酶及其抑制剂，稳定肠道微生物细胞。溶液D用于对胶块中的微生物细胞进行裂解。溶液E使融化的胶块中的蛋白质发生变性并使其与DNA分离，萃取部分糖、脂类等杂质。溶液F使残留Tris酚溶解到有机相中，进一步去除杂质。溶液G的作用是沉淀DNA。溶液H的作用是清洗和沉淀DNA。

本发明还提供了一种使用上述试剂盒之鱼肠道微生物宏基因组总DNA的提取方法，其包括以下步骤：

步骤一，将新鲜的样品鱼击昏，用吸水纸吸干样品鱼体表液体，用75％的酒精擦拭样品鱼体表面，置于-20℃冰箱内进行冷冻15-30分钟；

步骤二，使用溶液A配制琼脂糖凝胶溶液，在保温箱内使其平衡到65℃；

步骤三，迅速取出上述步骤一得到的样品鱼，使用步骤二得到的琼脂糖凝胶溶液涂渍样品鱼体表，对样品鱼体表微生物进行固定；冷却后使用灭菌手术剪迅速对鱼体进行解剖，分离得到鱼肠道；

步骤四，使用无菌过滤器吸取对应量的溶液B缓慢注入上述步骤三得到的鱼肠道，重复洗脱3次，将冲洗得到的鱼肠道内容物收集得到鱼肠道内容物溶液；

步骤五，将上述步骤四得到的鱼肠道内容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩涡震荡10-15分钟，得到悬浊液；

步骤六，将8层80目尼龙网纱置于布氏漏斗上，抽滤上述步骤五得到的悬浊液，使用对应量的溶液B清洗沉淀物，并收集滤液；

步骤七，将步骤六所得的滤液在10000rpm条件下离心10分钟并收集沉淀，然后用溶液C重悬沉淀，重复3次，得到下菌体沉淀备用；

步骤八，使用溶液A配置浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶，平衡其温度到45℃；将步骤七得到的菌体沉淀预热到45℃后，向其中加入该1％的低熔点琼脂糖凝胶，混合均匀后注入模具，并在4℃下凝固12小时，得到凝胶；

步骤九，将步骤(8)得到的凝胶浸入溶液D中，37℃下恒温震荡清洗12小时；

步骤十，将清洗后的凝胶放入低熔点琼脂糖电泳槽中，使用1％的低熔点琼脂糖凝胶进行封闭，在60v条件下电泳10分钟，并在紫外灯下迅速切下琼脂，得到琼脂糖凝胶；

步骤十一，将步骤十切下的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液A后，加热到65℃融化，并立即加入等体积溶液E，摇晃混匀，在12000rpm条件下离心5分钟，得到水相；

步骤十二，将步骤十一得到的水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入相同体积的溶液F，在12000rpm条件下离心5分钟，得到相应水相，

步骤十三，将步骤十二得到的相应水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍体积预冷溶液G，在-80℃条件下静置沉淀12小时，然后在进行10000rpm条件下离心10分钟；然后向其中加入少量的溶液H重复洗涤2次，得到DNA沉淀；

步骤十四，将步骤十三得到的DNA沉淀在室温下进行干燥，去除酒精对实验结果的影响，然后加入相应量的溶液A溶解得到相应DNA

为了更详尽的描述本发明，以下列举更为详尽的实施例进行说明。

(1)将新鲜的小黄鱼击昏，用吸水纸吸干体表液体，用75％的酒精擦拭鱼体表面，置于-20℃冰箱内进行冷冻15-30分钟；

(2)使用溶液A配制琼脂糖凝胶溶液，在保温箱内使其平衡到65℃；

(3)迅速取出上述步骤(1)得到的鱼体，使用步骤(2)得到的琼脂糖凝胶溶液涂渍鱼体表，对其体表微生物进行固定，冷却后使用灭菌手术剪迅速对鱼体进行解剖，小心分离得到鱼肠道；

(4)使用无菌过滤器吸取5mL的溶液B缓慢注入上述步骤(3)得到的鱼肠道，重复洗脱3次，将冲洗得到的鱼肠道内容物收集得到鱼肠道内容物溶液；

(5)将上述步骤(4)得到的鱼肠道内容物溶液置于三角瓶中，加入玻璃珠漩涡震荡10-15分钟，得到悬浊液；

(6)将8层80目尼龙网纱置于布氏漏斗上，抽滤上述步骤(5)得到的悬浊液，使用15mL的溶液B清洗沉淀物，并收集滤液；

(7)将步骤(6)所得的滤液在10000rpm条件下离心10分钟并收集沉淀，然后用溶液C重悬沉淀，重复3次，得到下菌体沉淀备用；

(8)使用溶液A配置浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶，平衡其温度到45℃；将步骤(7)得到的菌体沉淀预热到45℃后，向其中加入该1％的低熔点琼脂糖凝胶，混合均匀后注入模具，并在4℃下凝固12小时，得到凝胶；

(9)将步骤(8)得到的凝胶浸入溶液D中，37℃下恒温震荡清洗12小时；

(10)将清洗后的凝胶放入低熔点琼脂糖电泳槽中，使用1％的低熔点琼脂糖凝胶进行封闭，在60v条件下电泳10分钟，并在紫外灯下迅速切下琼脂，得到琼脂糖凝胶；

(11)将步骤(10)切下的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液A后，加热到65℃融化，并立即加入等体积溶液E，摇晃混匀，在12000rpm条件下离心5分钟，得到水相；

(12)将步骤(11)得到的水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入相同体积的溶液F，在12000rpm条件下离心5分钟，得到相应水相；

(13)将步骤(12)得到的相应水相移到另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍体积预冷溶液G；

(14)在-80℃条件下静置沉淀12小时，然后在进行10000rpm条件下离心10分钟；

(15)然后向其中加入少量的溶液H重复洗涤2次，得到DNA沉淀；

(16)将步骤(15)得到的DNA沉淀在室温下进行干燥，去除酒精对实验结果的影响；

(17)加入100μL的溶液A溶解得到相应DNA。

如图1以及表1所示的，表1为使用nanodrop超微量风光光度计分析样品浓度及纯度结果。

表1

其中，样品1：为本发明试剂盒提取样品；M：分子量标marker；样品2：为SDS法提取样品；样品3：为CTAB法提取样品；样品4：为柱层析试剂盒1提取样品；样品5：为柱层析试剂盒2提取样品；样品6：为柱层析试剂盒3提取样品。表明：使用常规SDS和CTAB法提取得到的DNA发生了严重降解，不能达到宏基因组研究的要求；使用柱层析DNA提取试剂盒法获得的DNA样品条带弥散，也有一定程度的降解和蛋白污染。使用本试剂盒提取的DNA样品条带清晰，降解量少，没有蛋白质污染和RNA残留，所获得的DNA的纯度和质量高。

其更为具体的如图2所示的，其中，样品7为空白，样品8为以小黄鱼肠道DNA样品增得到的16s rRNA基因，样品9为以黑鱼肠道DNA样品扩增得到的16s rRNA基因；M：分子量标marker。从图2中可以看出，用该土壤DNA可以扩增出明亮的，预期大小的专一目的条带，表明使用该DNA提取方法和试剂盒提取的鱼肠道DNA满足普通PCR扩增要求。使用该DNA提取方法和试剂盒提取黑鱼和小黄鱼肠道微生物DNA，通过illumina高通量测序分别获得了5.11G和5.20G的测序数据，使用SoapAligner软件进行分析后发现，宿主和挠足类生物DNA仅占测序数据的0.01％和0.03％。表明该提取方法可以有效避免鱼体本身和食物DNA的污染。

当然，以上说明仅仅为本发明的较佳实施例，本发明并不限于列举上述实施例，应当说明的是，任何熟悉本领域的技术人员在本说明书的教导下，所做出的所有等同替代、明显变形形式，均落在本说明书的实质范围之内，理应受到本发明的保护。