一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法与流程

本发明属于基因组提取
技术领域：
，尤其涉及一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法。
背景技术：
：蔷薇属野生种是月季遗传资源的主要来源，现代约25000多个月季品种均来自15个蔷薇属原始亲本的不断杂交和回交。由于长期的定向选择和人工栽培，使得现代月季部分抗病基因流失、抗病性较差。目前野生蔷薇资源的优异基因转移到现代月季的栽培品种中，拓宽其遗传基础、培育抗病新品种为抗病育种的主要方向。但由于存在杂交不亲与杂种不育、病原菌生理小种具有高度多样性和变异性，以及大规模引种后，其抗性难以维持等问题，所以通过杂交育种尚不能彻底解决病害防治的问题。植物内生真菌是真菌的重要组成部分，是指在其生活史的一定或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的真菌，在各类花卉植物中，内生菌的定殖十分普遍。由于长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，内生菌与植物之间形成了一种互惠共生关系：植物为内生菌提供生长所需环境和各类营养物质，而内生菌则通过产生种类繁多的生物活性物质来刺激宿主植物的生长发育，提高其对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力，国外已有大量关于利用内生菌增强植物病害防控能力的专利，所以探究内生菌增强宿主植物对各种病原菌的抵抗力具有较大的实践意义。使用分子生物学方法分析微生物群落结构是目前最重要、最迅速的菌群结构与功能认识的方法之一。在内生菌群落结构研究中，常用的方法是使用特异性引物进行系统发育标记分子的扩增，并通过测定其序列来识别微生物群落的物种组成并定量其丰度。本发明中提取野生蔷薇内生真菌基因组DNA，利用18SrRNA基因扩增、高通量测序的方法，为探明抗病野生蔷薇特有和优势内生真菌抗病功能群，及野生蔷薇抗病的分子机制打下夯实的基础。野生蔷薇中含有大量多酚、酯类等次生代谢产物、色素、酚基、酚羟基等酚类化合物，致使基因组DNA提取率低、纯度低，对后续分子生物学方面的分析造成阻碍。研究表明，改良CTAB法可提取高质量玫瑰DNA(严廷良等，2014)，但提取高质量的野生蔷薇内生真菌基因组DNA的方法未有研究报道，而且用普通试剂盒及CTAB法提取效果较差，提取到的内生真菌基因组DNA得率少纯度低。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法。本发明能够实现高效提取大量野生蔷薇内生真菌基因组的目的，得到的内生真菌基因组DNA纯度高，得率高。本发明的技术方案如下：一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法，所述方法将野生蔷薇表面消毒、液氮研磨处理后，采用CTAB混合液结合土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取内生真菌基因组DNA。进一步地，所述CTAB混合液中CTAB的质量百分比为1.8～2.2％、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)的浓度为9～11％(m/v)。进一步地，所述土壤微生物DNA强力提取试剂盒为试剂盒。进一步地，所述野生蔷薇表面消毒操作如下：将野生蔷薇植物组织置于70％酒精中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为1～2min；无菌水清洗数次后；将植物组织再置于4～6％次氯酸钠溶液中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为30～60s；无菌水清洗数次，完成消毒。作为优选，所述方法操作如下：将表面消毒后的植物组织剪碎，置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨至细粉末状，称取研磨后的粉末置于预热后的CTAB混合液中，研磨至粘稠状混合物，混合物涡旋混匀后，加入试剂盒中的SolutionC1，上下颠倒数次混匀，涡旋振荡、离心后将上清液转移到新的收集管中，加入SolutionC2，涡旋混匀，孵育、离心；转移上清夜到新的收集管中，加入SolutionC3，涡旋混匀，孵育，离心；转移上清到新的收集管中，加入SolutionC4，涡旋混匀后放入旋转过滤器、中，离心弃去滤液，继续加载、上清，室温、离心，重复直至过滤完所有上清；加入SolutionC5到旋转过滤器中，室温离心，弃去上清后，转移旋转过滤器到收集管中，然后加入SolutionC6到白色滤膜中心，离心弃去旋转过滤器；得到总DNA样品，放置-20℃的冰箱中保存，备用。进一步地，所述CTAB混合液中CTAB的质量百分比为1.8～2.2％、β-巯基乙醇的浓度为1.8～2.2％(v/v)和PVP的浓度为9～11％(m/v)。进一步地，所述CTAB混合液使用前预热至60～70℃。作为进一步优选，所述方法具体操作如下：称取0.15g研磨后的植物组织粉末，置于一个干净无菌研磨中；加入600μL预热至60～65℃的CTAB混合液，充分研磨至粘稠状；再用无菌滤纸收集研磨后的混合物并加入到一个PowerBeadTubes中，轻轻涡旋混匀，加入60μLSolutionC1，上下颠倒数次混匀；把PowerBeadTubes固定在涡旋仪适配器上，3200r/m涡旋连续振荡10～15min，室温10000×g离心30～60s；转移上清至一个干净的2mL收集管中，加入250μLSolutionC2到上清中，涡旋混匀5～6s，4℃孵育5min，室温10000×g离心1～2min；避开沉淀小珠，转移上清≤600μL到一个新的收集管中，加入200μLSolutionC3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min，室温10000×g离心1～2min；避开沉淀小珠，转移上清≤750μL到一个新的收集管中，加入1200μLSolutionC4到上清中，涡旋混匀5～6s，加载约675μL上清到旋转过滤器中，室温10000×g离心1min，弃去滤液，继续加载675μL上清，室温10000×g离心1～2min，重复直至过滤完所有上清；加入500μLSolutionC5到旋转过滤器中，室温10000×g离心30～60s，弃去上清，室温10000×g离心1～2min；小心转移旋转过滤器到2mL收集管中，加入100μLSolutionC6到白色滤膜中心，室温10000×g离心30～60s，弃去旋转过滤器；将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存，备用。本发明通过表面消毒去除样品表面微生物，避免其表面微生物对内生真菌基因组DNA造成污染，液氮研磨的处理可有效破解真菌细胞壁；CTAB提取液中加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和巯基乙醇能起到保护DNA的作用，另外，土壤微生物DNA强力提取试剂盒中包含了创新专利抑制因子去除(IRT)，可有效去除样品中的抑制因子(如腐植酸、细胞碎片、蛋白质等)对DNA提取的干扰。巯基乙醇、PVP和土壤微生物DNA强力提取试剂盒的共同作用下，提取基因组过程中DNA免受醌类、酚类、多酚氧化酶等物质损害以及其他抑制因子的干扰，从而提高内生真菌基因组DNA提取率。本发明提取出的DNA得率高，纯度高，得到的高质量DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化。本发明提供的方法应用于野生蔷薇大理紫花(R.multiflora)内生真菌基因组和野生蔷薇七姐妹(R.multifloravar.carnea)内生真菌基因组的提取，都达到良好的提取效果，提取的基因组DNA均可用于各类分子学实验。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明针对野生蔷薇样品的特殊性进行设计，避免野生蔷薇植物中所含醌类物质、酚类物质、多酚氧化酶及破壁不充分等因素对基因组DNA提取效率的不良影响。此方法可以运用于所有野生蔷薇内生菌基因组的提取，具有应用范围广、提率高的特点。附图说明图1是液氮研磨与CTAB法相结合的方法提取野生蔷薇内生真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱；图2是液氮研磨与土壤微生物DNA强力提取试剂盒相结合的方法提取野生蔷薇内生真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱；图3是液氮研磨结合CTAB混合液与土壤微生物DNA强力提取试剂盒的方法提取野生蔷薇内生真菌18SrRNA基因扩增的琼脂糖凝胶电泳图谱。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。本发明所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。实施例中所使用的材料、试剂如无特殊说明，均可通过商业途径获得，美国MOBIO强力土壤DNA提取试剂盒试剂盒(DNAIsolationKit)购买于深圳市安必胜科技有限公司。本发明前期处理野生蔷薇样品时，所有接触到的工具必须经过高温高压灭菌，以免带入外界微生物污染样品。在研磨植物样品时，要保证研磨力度大，第一次研磨样品至细粉末状，第二次研磨时，要保证研磨时间至少为5分钟，使样品与CTAB混合液反应充分，磨至样品为粘稠状。使用试剂盒提取DNA过程中，收集上清液时要尽量避免吸取到下层沉淀物质，否则会影响DNA的纯度，加载上清液过滤时要过滤完所有上清，否则会影响DNA的获得率。实施例1液氮研磨结合CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取野生蔷薇内生真菌基因组(1)试剂的制备：样品前处理试剂有0.5MEDTA(pH＝8.0)、1MTris-HCl溶液、CTAB溶液、β-巯基乙醇、酚：氯仿：异戊醇、异丙醇、质量百分比浓度70％的乙醇、无水乙醇、5％次氯酸钠；所述试剂的配制方法如下：70％酒精的配制：分别量取60mL无菌去离子水和140mL无水乙醇，混合，室温保存。5％次氯酸钠的配制：分别量取100mL的10％次氯酸钠和100mL的无菌去离子水，混合，室温避光保存。0.5MEDTA(pH＝8.0)的配制：取186.1gNa2EDTA·2H2O，用NaOH(约20g)调节pH＝8.0，用过滤的ddH2O混合至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。1MTris-HCl(pH＝8.0)的配制：称取Tris-base121.1g，将其溶解在800mL去离子水中，加入约42mL浓盐酸将其pH调至8.0，最后，加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存。2％CTAB提取液的配制：称取20gCTAB，81.9gNaCl；量取1MTris-HCl(pH＝8.0)溶液100mL，0.5MEDTA(pH＝8.0)溶液40mL；加去离子水定容至1L，灭菌(121℃，15min)，室温保存，使用前加0.2％(V/V)β-巯基乙醇。其他试剂可通过试剂公司购买。(2)样品的表面消毒称取2g野生蔷薇样品；将已配制70％酒精和5％次氯酸钠溶液分装至两个250mL无菌烧杯中；将植物组织置于70％酒精中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为2min；无菌水清洗三次；将植物组织块再置于5％次氯酸钠溶液中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为1min；无菌水清洗五次；将已完成表面消毒的植物组织收集于无菌滤纸中。(3)CTAB法提取基因组DNA1)称取2g样品，置于预冷研钵中加液氮覆盖，快速用力研磨至粉末状；2)向研钵中加入约600μl，65℃预热的2％CTAB提取液，将其与研磨后的粉末混匀；3)将液体转移至1.5mL的离心管内，涡旋震荡后于65℃水浴1h，每20min上下颠倒轻轻混匀一次；4)水浴结束后取出离心管，在每个离心管中加入等体积的4℃预冷后的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀后，12000r/min，4℃，离心15min；5)离心后将上清转入新的1.5mL离心管中，再次加入等体积的4℃预冷后的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，上下颠倒混匀，12000r/min，4℃，离心15min；6)离心后将上清转入新的1.5mL离心管中，并向上清中加入-20℃预冷后的异丙醇(0.6倍体积)，上下颠倒混匀，置于-20℃的冰箱中沉淀至少2h；7)沉淀时间结束后从冰箱取出离心管，12000r/min，4℃，离心15min，取沉淀。向离心管中加入1mL，-20℃预冷后的体积分数为70％的乙醇，反复吹打漂洗沉淀，12000r/min，4℃，离心15min，弃液体，取沉淀。再重复此操作一次；8)将装有沉淀的离心管倒置于无菌滤纸上，并置于超净工作台自然风干，风干后，向每管加入50μl的双蒸水溶解DNA；9)溶解后的DNA于-20℃冰箱中保存；(4)18SrRNA基因扩增检测提取的DNA基因组利用18SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18SrRNA基因，证明成功提取了基因组。图1中从左至右有4个泳道，由图1可以发现：2、3、4泳道没有明显的DNA目的条带，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是失败的。实施例2液氮研磨结合土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取野生蔷薇内生真菌基因组(1)试剂的制备：样品前处理试剂有70％无水乙醇及5％次氯酸钠配制方法同实施例1，DNA提取试剂盒采用试剂盒，试剂盒中含有SolutionC1～SolutionC6。(2)样品的表面消毒称取2g野生蔷薇样品；将已配制70％酒精和5％次氯酸钠溶液分装至两个250mL无菌烧杯中；将植物组织置于70％酒精中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为1～2min；无菌水清洗三次；将植物组织块再置于5％次氯酸钠溶液中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为30～60s；无菌水清洗五次；将已完成表面消毒的植物组织收集于无菌滤纸中。(3)利用液氮研磨处理和试剂盒相结合的方法提取真菌基因组将已表面消毒的样品置于预冷研钵中加液氮覆盖，用力充分研磨(反复加液氮研磨)至细粉末状。采用土壤微生物DNA强力提取试剂盒提取总DNA，具体操作步骤如下：1)加入0.15g研磨后的粉末到一个PowerBeadTubes中；2)轻轻涡旋混匀；3)检测SolutionC1，若出现沉淀，60℃水浴至全溶解；4)加入60μlSolutionC1，上下颠倒数次混匀；5)把PowerBeadTubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200rpm)涡旋连续振荡10～15min；6)室温10000×g离心30～60s；7)转移上清至一个干净的2mLCollectionTube(试剂盒提供)中；8)加入250μlSolutionC2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min；9)室温10000×g离心1～2min10)避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中11)加入200μlSolutionC3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min12)室温10000×g离心1～2min；13)避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中；14)加入1200μlSolutionC4(SolutionC4使用前先摇匀)到上清中，涡旋混匀5s；15)加载约675μl上清到SpinFilter中，室温10000×g离心1～2min；弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1～2min；重复直至过滤完所有上清；16)加入500μlSolutionC5到SpinFilter中，室温10000×g离心30～60s；17)弃去上清；18)室温10000×g离心1～2min；19)小心转移Spinfilter到2mLCollectionTube(试剂盒提供)中，尽量避免SolutionC5污染；20)加入100μlSolutionC6到白色滤膜中心；21)室温10000×g离心30～60s；22)弃去SpinFilter。将总DNA样品放置-20℃的冰箱中保存，备用；(4)18SrRNA基因扩增检测提取的DNA基因组；利用18SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18SrRNA基因，证明成功提取了基因组。由图2可以发现：2、3、4泳道有18SrRNA基因扩增目的条带，但是不够明显，大小约为500bp，其中2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验所获得的DNA得率较低。实施例3液氮研磨结合CTAB混合液与试剂盒提取野生蔷薇内生真菌基因组(1)试剂的制备：样品前处理试剂有0.5MEDTA(pH＝8.0)、1MTris-HCl溶液、CTAB提取液、70％无水乙醇、5％次氯酸钠、CTAB混合液、β-巯基乙醇、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)；所述试剂的配制方法如下：所述0.5MEDTA(pH＝8.0)、1MTris-HCl溶液、CTAB提取液、70％无水乙醇、5％次氯酸钠的配制方法同实施例1所述所述CTAB混合液的配制：量取2％CTAB提取液200mL，加入20gPVP，灭菌(115℃，15min)，室温保存，使用前加4mL的β-巯基乙醇。其他试剂可由试剂盒提供或通过试剂公司购买。(2)样品的表面消毒称取2g野生蔷薇样品；配制70％酒精和5％次氯酸钠溶液分装至两个250mL无菌烧杯中；将植物组织置于70％酒精中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为1～2min；无菌水清洗三次；将植物组织块再置于5％次氯酸钠溶液中，使所有的植物组织完全浸泡，浸泡时间为30～60s；无菌水清洗五次；将已完成表面消毒的植物组织收集于无菌滤纸中。(3)液氮研磨处理样品将已表面消毒的植物组织剪碎，置于预冷研钵中加液氮覆盖，充分研磨至细粉末状。(4)使用CTAB混合液结合试剂盒提取样品基因组DNA1)称取0.15g上述研磨后的细粉末，置于一个干净无菌研磨中。2)加入600μl预热至65℃的CTAB混合液，将其与研磨后的粉末混匀，充分研磨至粘稠状，再用无菌滤纸收集研磨后的样品。3)加入上述研磨后的混合物到一个PowerBeadTubes中。4)轻轻涡旋混匀。5)检测SolutionC1，若出现沉淀，60℃水浴至完全溶解。6)加入60μlSolutionC1，上下颠倒数次混匀。7)把PowerBeadTubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200r/min)涡旋连续振荡10～15min。8)室温10000×g离心30～60s。9)转移上清至一个干净的2mLCollectionTube中。10)加入250μlSolutionC2到上清中，涡旋混匀5s，4℃孵育5min。11)室温10000×g离心1～2min。12)避开沉淀小珠，转移上清≤600μl到一个新的收集管中。13)加入200μlSolutionC3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min。14)室温10000×g离心1～2min。15)避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中。16)加入1200μlSolutionC4到上清中，涡旋混匀5s。17)加载约675μl上清到SpinFilter中，室温10000×g离心1～2min；弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000×g离心1～2min；重复直至过滤完所有上清。18)加入500μlSolutionC5到SpinFilter中，室温10000×g离心30～60s。19)弃去上清。20)室温10000×g离心1～2min。21)小心转移Spinfilter到2mLCollectionTube中，尽量避免SolutionC5污染。22)加入100μlSolutionC6到白色滤膜中心。23)室温10000×g离心30～60s。24)弃去SpinFilter。(5)18SrRNA基因扩增检测提取的DNA基因组利用18SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18SrRNA基因，证明成功提取了基因组。由图3可以发现：2、3、4泳道有明显的18SrRNA基因扩增目的条带，大小约为500bp，2、3、4泳道为三个样品的重复实验，表明本实验的DNA提取是成功的，并且DNA提取率高。比较实施例1～实施例3的基因组DNA纯度、浓度和OTU数，结果如表1所示。表1提取方法纯度(OD260/OD280)浓度(ng/μl)OTU数(个)实施例16.96.97＜25实施例21.26328.0775实施例31.67337.311750对DNA纯度来说，1.6－1.9最合适，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA，故采用本发明提供的提取方法DNA纯度较高。由表1中可看出实施例3的DNA浓度高于实施例1和实施例2。对OUT数来说，OUT个数越多，说明提取到物种基因组DNA越丰富，覆盖类群越广，越能真实反映植物样品中内生菌的丰度。由表1中还可看出实施例3的OUT数远远多于实施例1和实施例2。实施例4在实施例3的基础上，改变CTAB混合液的成分，不加入PVP。CTAB混合液配置方法如下：量取2％CTAB提取液200mL，使用前加入4mL巯基乙醇。其他提取过程同实施例3，利用18SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18SrRNA基因，证明成功提取了基因组。但凝胶电泳图中，18SrRNA基因扩增的目的条带并不明显，提取出的DNA得率较低，故提取野生蔷薇基因组DNA过程中PVP必不可少。实施例5在实施例3的基础上，改变CTAB混合液的成分，不加入巯基乙醇。CTAB混合液配置方法如下：量取2％CTAB提取液200mL，加入20gPVP，灭菌(115℃，15min)，室温保存。其他提取过程同实施例3，利用18SrRNA基因扩增的通用引物，以提取的基因组为模板，在53℃退火，进行琼脂糖凝胶电泳并观察结果，如果能够扩增出真菌的18SrRNA基因，证明成功提取了基因组。但凝胶电泳图中，18SrRNA基因扩增的目的条带较明显，但条带亮度不及实施例3，说明提取出的DNA得率一般，所测得纯度较低，故提取野生蔷薇基因组DNA过程中CTAB混合液中最好也加入巯基乙醇。当前第1页1 2 3