一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用。

背景技术：

杆状病毒是一类广泛存在于自然界的昆虫病毒，其感染能够导致昆虫的液化死亡。杆状病毒的基因组由一条双链环状DNA组成，基因组大小在80-180kb之间。杆状病毒的生活周期中产生两种不同形态的病毒粒子：出芽型病毒粒子(budded virus，BV)和包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus，ODV)。两种病毒粒子分别介导了杆状病毒生活周期中的口服感染和系统感染两个阶段。

随着研究的深入，杆状病毒已在生物防治、真核基因表达、表面展示以及基因治疗等方面得到越来越广泛的应用。重组杆状病毒，可通过改良病毒基因组，提高杆状病毒的性能，进一步促进杆状病毒的应用。例如在真核基因表达、表面展示以及基因治疗等方面的应用中，一般只应用杆状病毒的出芽型病毒粒子BV，故去除与BV不相关的基因可以简化病毒基因组，扩大外源基因的容量。另外，杆状病毒作为生物杀虫剂在农业领域受到宿主谱狭窄的限制，开发宿主域广谱的杆状病毒作为高效的生物杀虫剂具有重要的农业应用价值。在这个过程中都需要对杆状病毒基因组进行遗传改造，从而构建出性能良好的重组杆状病毒。

目前，比较常用的杆状病毒基因组改造技术是同源重组技术。同源重组技术每次只能缺失(替换)一个或者多个串联在一起的基因。这使得同源重组技术在大规模不同位点的遗传改造方面的应用受到了阻碍。

合成生物学技术是近些年发展起来的人工合成大分子DNA的技术，在合成的过程中可以定向改造DNA，且可以进行多个位点的改造。合成生物学已经被用于一些RNA病毒和小DNA病毒的构建，但对于基因组大于40kb的病毒，由于基因组的复杂性以及病毒拯救的难点，尚无技术上的突破。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种杆状病毒基因组的合成方法；以解决杆状病毒人工合成的技术难点。

本发明的第二目的在于提供上述合成方法在合成杆状病毒基因组中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述合成方法所得到的杆状病毒基因组在构建重组杆状病毒中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种杆状病毒基因组的合成方法，该合成方法包括使用引物组合和穿梭载体，引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，杆状病毒全基因组扩增引物组合包括第1-45引物对，第1-45引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；线性载体扩增引物组合包括第46-54引物对，第46-54引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.91-108所示；穿梭载体的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

上述的合成方法在合成杆状病毒基因组中的应用，包括：以杆状病毒基因组为模板，用第1-45引物对分别进行PCR扩增反应，得到第1-45目的基因组片段；

以线性化的第一载体为模板，用第46-54引物对分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段；

将第1-45目的基因组片段分为9组，9组目的基因组片段依次与带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段对应；每一组的目的基因组片段与线性化载体目的片段一起转化到宿主细胞，得到第1-9重组质粒；

将第1-9重组质粒用限制性内切酶BamHI酶切，得到线性化的第1-9重组片段；

以线性化的第一载体为模板，以SEQ ID No.92和SEQ ID No.95为引物对、SEQ ID No.98和SEQ ID No.101为引物对、SEQ ID No.104和SEQ ID No.107为引物对，分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第55-57线性化载体目的片段；

并将第1-9重组片段，分为三组，第一组的3个线性化的重组片段与带有同源臂的第55线性化载体片段一起转化到宿主细胞，第二组的3个线性化的重组片段与带有同源臂的第56线性化载体片段一起转化到宿主细胞，第三组的3个线性化的重组片段与带有同源臂的第57线性化载体片段一起转化到宿主细胞，得到第10-12重组质粒；用限制性内切酶Bsu36I将第10-12重组质粒酶切，得到线性化的第10-12重组片段；以线性化的第二载体为模板，以SEQ ID No.101和SEQ ID No.104为引物对，进行PCR扩增，得到带有同源臂的线性化的第二载体目的片段；将第10-12重组片段与所述第二载体目的片段一起转化宿主细胞，得到杆状病毒基因组质粒。

上述合成方法所得到的杆状病毒基因组在构建重组杆状病毒中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的一种杆状病毒基因组的合成方法，使用该方法能快速准确的复制出杆状病毒基因组；合成杆状病毒基因组的引物组合全面覆盖杆状病毒基因组，方便合成杆状病毒基因组的任意一个片段，并且方便对杆状病毒基因组的任意位点进行改造。本发明提供的穿梭载体，具有可在昆虫细胞中进行检测的egfp基因，方便对人工合成病毒基因组的拯救；利用本发明提供的杆状病毒人工合成方法，可对杆状病毒基因组进行改造，并对合成的基因组进行拯救，方便重组杆状病毒的构建和推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的片段设计和载体扩增引物设计原理示意图；

图2为本发明实施例2提供的目的片段与pGF载体在酵母原生质体中进行同源臂重组的示意图；

图3为本发明实验例1提供的重组杆状病毒基因组酶切鉴定图谱；

图4为本发明实验例2提供重组杆状病毒一步生长曲线；

图5为本发明实验例3提供病毒电镜图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

pGF质粒由中国科学院武汉病毒研究所肖庚富老师实验室构建(专利号：CN 104087610)，公众可获得；酵母VL6-48菌株及大肠杆菌EPI300菌株均由中国科学院武汉病毒研究所肖庚富老师实验室提供，公众可获得。

下面对本发明实施例的一种杆状病毒基因组的合成方法及其在重组杆状病毒构建中的应用进行具体说明。

杆状病毒的基因组一般较大，约80-180kb，如果要对一个具体的基因或者多基因进行点突变，由于杆状病毒的基因组较大，每次全基因组合成较为麻烦，也容易出现点突变或者碱基缺失、移码突变等一些常见的问题，本发明提供一系列引物组合分段扩增杆状病毒基因组，将扩增的片段连接到克隆载体上，方便对步骤病毒基因组上的任意一点进行改造修饰。

一种杆状病毒基因组的合成方法，合成方法包括使用引物组合和穿梭载体，引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，杆状病毒全基因组扩增引物组合包括第1-45引物对，第1-45引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；线性载体扩增引物组合包括第46-54引物对，第46-54引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.91-108所示；穿梭载体的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

进一步地，穿梭载体具有能在酵母和细菌中复制的能力，同时带有由hsp70启动子启动的egfp基因，可在转染昆虫细胞时产生荧光，达到筛选的目的。

上述合成方法在合成重组杆状病毒中的应用，其包括：

以杆状病毒基因组为模板，将引物组合中的第1-45引物对分别进行PCR扩增反应，得到第1-45目的基因组片段；第1目的基因组片段是对应第1引物对的产物，第2目的基因组片段是对应第2引物对的产物，以此类推，第45目的基因组片段是对应第45引物对的产物。

将扩增的目的片段回收并纯化，获得纯化的45个目的片段；PCR扩增反应包括以杆状病毒基因组DNA为模板进行PCR反应；

PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；52-59℃，30s；68℃，2min；30个循环；68℃，10min。

通过PCR扩增反应，可以获得大量的45个目的片段，但是扩增反应体系中，含有一些杂质；通过电泳回收并且纯化，可以获得纯化的目的片段。

在PCR扩增反应的时候，不同的引物对的退火温度不同，把退火温度控制在52-59℃的范围内，有利于获得单一的条带；以线性化的第一载体为模板，将第46-54引物对分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段；

将第1-45目的基因组片段分为9个组，第1-5目的片段为第1组，第6-10目的片段为第2组，第11-16目的片段为第3组，第17-21目的片段为第4组，第22-27目的片段为第5组，第28-32目的片段为第6组，第33-37目的片段为第7组，第38-41目的片段为第8组，第42-45目的片段为第9组；9组目的基因组片段分别依次与第46-54带有同源臂的线性化载体片段一起转到酵母细胞；第1组转化后得到第1重组质粒，依次类推，第9组转化后获得第9重组质粒。

用限制性内切酶Bsu36I将第1-9重组质粒进行酶切，得到第1-9重组片段；并将第1-9重组片段分为三组，第1-3重组片段为第一组，第4-6重组片段为第二组，第7-9重组片段为第三组。

以线性化的第一载体为模板，分别以SEQ ID No.92和SEQ ID No.95为引物对、SEQ ID No.98和SEQ ID No.101为引物对、SEQ ID No.104和SEQ ID No.107为引物对，分别进行PCR扩增，得到带有同源臂的第55-57线性化载体目的片段。

第一组的3个重组片段与带有同源臂的第55线性化载体目的片段一起转化到宿主细胞，经过宿主细胞的同源重组，得到第10重组质粒；第二组的3个重组片段与带有同源臂的第56线性化载体目的片段一起转化到宿主细胞，经过宿主细胞的同源重组，得到第11重组质粒；第三组的3个重组片段与带有同源臂的第57线性化载体目的片段一起转化到宿主细胞，经过宿主细胞的同源重组，得到第12重组质粒。

用限制性内切酶Bsu36I酶切第10-12重组质粒，得到线性化的第10-12重组片段；以线性化的第二载体为模板，将线性化引物组合中的SEQ ID No.101和SEQ ID No.104为引物对，进行PCR扩增，得到带有同源臂的线性化的第二载体目的片段；将第10-12重组片段与带有同源臂的线性化的第二载体目的片段一起转化宿主细胞，得到杆状病毒基因组质粒。

进一步地，宿主细胞为VL6-48株酵母细胞的原生质体。

宿主细胞优选为酵母VL6-48株细胞，并选用酵母的原生质体进行转化实验。通过将扩增的4-6个相邻的目的片段与带有同源臂的线性化载体片段一起转化进入酵母原生质体细胞内。

进一步地，第一载体质粒优选为pGF。

该质粒是由细菌人工染色体质粒pCC1BAC改造而来，在pCC1BAC质粒上加入酵母人工染色体元件(His3，ARSH4和CEN6)形成能在大肠杆菌和酵母内生长的穿梭质粒；该质粒由中国科学院武汉病毒研究所肖庚富老师实验室构建，公众可获得。

进一步地，第二载体为pGF-egfp。

pGF-egfp载体是在pGF质粒上改造而来，将之前的lacZ基因替换成hsp70启动子操控下的egfp基因，该质粒的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

在实施过程中，还包括将重组质粒和线性化重组质粒转化大肠杆菌。通过大肠杆菌的复制，可以获得大量的质粒。

将目的片段和载体片段转化进宿主细胞后，宿主细胞能识别出目的片段的重叠区域，进行同源重组。

在实施过程中，还包括将第1-12重组质粒转化大肠杆菌。通过大肠杆菌的复制，可以获得大量的重组质粒，方便各种实验。

大肠杆菌有较多的种类，常见的TOP10、DH5α、BL21和EPI300等多种类型，本发明中优选大肠杆菌EPI300作为菌株大量复制重组质粒。

为方便从重组质粒中获取杆状病毒基因组片段，在设计扩增线性化载体的引物时引入酶切位点。通过序列酶切位点分析，选定限制性内切酶Bsu36I作为酶切序列设计添加到设计的引物序列上。

上述合成方法所得到的杆状病毒基因组在构建重组杆状病毒中的应用。

通过上述合成方法所得到的杆状病毒基因组，可以应用于构建具有生物活性的杆状病毒。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种杆状病毒基因组的合成方法，该合成方法包括使用引物组合和穿梭载体，引物组合包括杆状病毒全基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合，杆状病毒全基因组扩增引物组合包括第1-45引物对，第1-45引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；线性载体扩增引物组合包括第46-54引物对，第46-54引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.91-108所示；穿梭载体的碱基序列如SEQ ID No.109所示。

本实施例提供的引物的使用，具体方法如下：

1.1提取杆状病毒AcMNPV C6株的基因组DNA、质粒pGF和质粒pGF-egfp。

1.2以第1-45引物对分别进行PCR扩增反应；PCR扩增反应的反应体系是：5μL10×KOD PCR buffer，5μL的dNTPs(2mM each)，3μL的MgSO₄(25mM)，primer F和primer R各0.5μL(10pmol)，10ng AcMNPV C6基因组DNA，1μL KOD Plus polymerase，ddH₂O补足到50μL；PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，52-59℃退火30s，68℃延伸2min，30个循环，68℃延伸10min；

1.3以线性化的pGF载体为模板，将引物组合中的第46-54引物对分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段；以线性化的第一载体为模板，以SEQ ID No.92和SEQ ID No.95为引物对、SEQ ID No.98和SEQ ID No.101为引物对、SEQ ID No.104和SEQ ID No.107为引物对，分别进行PCR扩增反应，得到带有同源臂的第55-57线性化载体目的片段；

1.41.2的步骤中，获得45个目的片段，将相邻的4-6个目的片段一组，与带有同源臂的第46-54线性化载体目的片段一一对应，一起转化进入酵母原生质体细胞；

1.5通过同源臂重组，获得9个重组质粒，分别命名为pGF-B1到pGF-B9，将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌EPI300感受态细胞，培养增殖并提取质粒；

1.6用限制性内切酶Bsu36I将pGF-B1到pGF-B9质粒酶切，得到B1到B9重组片段，9个片段分为三组：B1到B3为第一组，与带有同源臂的第55线性化载体目的片段转化进入酵母原生质体细胞；B4到B6为第二组，与带有同源臂的第56线性化载体目的片段转化进入酵母原生质体细胞，B7到B9为第三组，与带有同源臂的第56线性化载体目的片段转化进入酵母原生质体细胞；

1.7通过同源臂重组，得到第10-12重组质粒；分别命名为pGF-C1、pGF-C2和pGF-C3，将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌EPI300感受态细胞，培养增殖并提取质粒；

1.8SEQ ID No.101和所述SEQ ID No.104为引物对，以限制性内切酶为BamHI酶切pGF-egfp质粒获得的线性化的pGF-egfp质粒片段为模板进行PCR反应，得到带有同源臂的线性化的pGF-egfp质粒片段；

1.9将pGF-C1、pGF-C2和pGF-C3三个质粒用限制性内切酶Bsu36I酶切，得到C1、C2和C3重组片段；

1.10重组片段C1、C2和C3与带有同源臂的线性化的pGF-egfp质粒片段一起转化进入酵母原生质体细胞，获得杆状病毒基因组的质粒，命名为AcMNPV-WIV-Syn1。

引物组合设计及目的片段与克隆载体同源臂重组的示意图见图1；图1中A表示相邻目的片段有重叠序列，图1中B表示线性化目的片段间用Bsu36I酶切序列连接，图1中C表示pGF载体质粒酶切示意图，图1中D表示两端带特异性靶标序列的DNA片段。

图2表示目的片段与pGF载体在酵母原生质体中进行同源臂重组的示意图。

酵母原生质体的制备方法参照参考文献(doi:10.1038/nprot.2008.5)，简单介绍如下：250mL锥形瓶中放入50mL YEPD液体培养基，接种生长在YEPD固体培养基上的单细胞克隆。30℃培养过夜(14-16h)，充分摇动确保通气良好。将培养物转入50mL离心管中，5℃1000g离心5min收集酵母细胞，弃去上清。用30mL灭菌水重悬沉淀的细胞，在涡旋仪上震荡混匀。5℃1000g离心5min收集酵母细胞，弃去上清。用20mL 1M山梨醇溶液重悬沉淀的细胞，在涡旋仪上震荡混匀。5℃1000g离心5min收集酵母细胞，弃去上清。用20mL SPE溶液重悬沉淀的细胞。加入20μL藤黄节杆菌酶溶液和40μLME到管中，混合均匀，并在30℃缓慢摇动孵育约60min。5℃570g离心原生质体10min。倒掉上清，加入50mL 1M山梨醇溶液，然后非常轻轻晃动来重悬沉淀。5℃条件下300–600g离心10分钟收集原生质体。用50mL 1M山梨醇溶液重复洗涤一次然后用2mL STC溶液重悬原生质体。

目的片段与带有同源臂线性化载体转化酵母原生质体细胞的方法参考文献(doi:10.1038/nprot.2008.5)，简单介绍如下：

在2mL EP管中，轻轻混匀200μL原生质体悬液和2-3mg基因组DNA以及1mg线性化的TAR载体。每个TAR克隆做3-5个平行转化反应。室温下孵育10min。每个EP管中加入800μL PEG 8000溶液，轻轻颠倒混匀并且在室温孵育10min。5℃300-500g离心5min沉淀原生质体。弃去上清，加入800μLSOS溶液，用移液枪轻轻混匀。30℃(不摇动)孵育原生质体40min。将每一个转化反应的原生质体转入到独立的含有15mL SORB-TOP-His选择培养基(50℃平衡)的50mL离心管，用移液器轻轻混匀，快速将琼脂倒入SORB-His选择培养基平板上。平板在30℃放置5-7天直到所有的转化株肉眼可以看见。

当然，本实施例中提供的合成方法所合成的杆状病毒基因组还可以应用于构建具有生物活性的重组杆状病毒。

实施例2

本实施例提供一种杆状病毒和重组杆状病毒合成的方法，方法包含实施例1提供的引物组合；基因组扩增引物组合和线性载体扩增引物组合；基因组扩增引物组合包括第1-45引物对中的一种或多种，第1-45引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-90所示；线性载体扩增引物组合包括第46-55引物对，第46-55引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.91-108所示。

方法的使用，参考实施例1提供的方法。

实验例1

本实验例对实施例2合成的重组杆状病毒AcMNPV-WIV-Syn1DNA进行鉴定。

将通过实施例2合成的AcMNPV基因组DNA经PCR、限制性内切酶酶切以及全基因组测序鉴定。

经鉴定片段大小与预期相符。酶切结果如图3所示(图中A表示PstⅠ、XhoⅠ和BglⅡ酶切位点在合成的AcMNPV基因组DNA序列中的分布和在野生型AcMNPV基因组中的分布，AcMNPV-C6表示野生型基因组，AcMNPV-WIV-Syn1表示合成的AcMNPV基因组；B表示酶切条带电泳预测，C表示基因组的酶切电泳图)，经过不同的限制内切酶的酶切以及电泳，合成的AcMNPV基因组DNA片段大小与预期相符，表明重组杆状病毒基因组构建成功。

实验例2

本实验例提供实施例2合成的杆状病毒AcMNPV基因组质粒的活性检测。具体方法如下：

1.1将5μL的cellfectin加入到95μL无血清的Grace培养基中，混合均匀，静置10min；

1.2将15μL AcBac-egfp-PH和AcMNPV-WIV-Syn1基因组质粒(约5μg)分别加入到85μL无血清的Grace培养基中，混合均匀，静置10min；

1.3将1.1和1.2中的溶液混合液加到一起，混合均匀，室温放置30min；

1.4将sf9细胞用无血清Grace培养基洗涤3次，加入600μL无血清的Grace培养基；再将混合液加入到含600μLGrace培养基的细胞中，每隔30min摇动一次；6h后，将培养基换成10％FBS的Grace培养基，继续培养96h后收集上清；

1.5将50μL收集的病毒感染细胞上清与长到80％的sf9细胞在27℃孵育1h，弃去上清；补充适量的2％FBS的Grace培养基，继续培养96h后收集上清；

1.6在小皿中，用10M.O.I.的病毒量孵育sf9细胞，27℃孵育1h，弃去上清；

1.7加入2mL无血清的Grace培养基，轻轻摇晃，吸弃上清，重复三次；

1.8加入1.5mL 2％FBS的Grace培养基。在加入2％FBS的Grace培养基后的0h、12h、24h、48h、72h和96h，吸取30μL的细胞培养上清；测定0h、12h、24h、48h、72h和96h样品的病毒滴度(细胞半数感染剂量，TCID₅₀)。以时间为横轴，TCID₅₀的对数值为纵轴，绘制一步生长曲线。

用野生型的病毒AcBac-egfp-PH(该病毒是在AcBacmid的转座位点转座上egfp和polyhedrin基因)作为对照，绘制合成的AcMNPV的一步生长曲线。结果如图4所示(图中AcMNPV-WIV-Syn1表示人工合成的重组杆状病毒，AcBac-egfp-PH表示对照病毒)，合成的AcMNPV-WIV-Syn1在12hpi就开始产生病毒，在48hpi达到平台期；且拥有与对照病毒AcBac-egfp-PH相似的一步生长曲线。以上说明本发明构建的重组病毒与对照病毒一样，可以在宿主细胞上正常生长。

实验例3

本实验例提供合成的重组杆状病毒AcMNPV-WIV-Syn1与野生型的杆状病毒AcMNPV-C6的电镜比较。

分别将实施例2合成的重组杆状病毒AcMNPV-WIV-Syn1与野生型的杆状病毒AcMNPV-C6注射感染5龄甜菜夜蛾幼虫后3-5天，收集死亡虫子，纯化病毒多角体进行电镜观察。

结果如图5所示(图中A表示合成AcMNPV病毒电镜照片，B表示野生型的杆状病毒AcMNPV-C6电镜照片)，电镜观察结果表明，合成的AcMNPV病毒多角体在大小、形态、结构以及ODV包埋等方面与野生型病毒AcMNPV-C6无明显差异。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种合成杆状病毒基因组的引物组合及应用与试剂盒

<160> 108

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 1

cgacagctga tagaagaaaa tactcgtctc 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 2

gatagatatg cgcaaacaac ccaact 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

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acgcgacgca caagtatctg tacac 25

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 4

gacgataatc ggcctaataa agctaacac 29

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 5

ctgtcgttag tgtacaattg actcgacg 28

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 6

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<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 7

cgtctatcat cttgaccgct tcgt 24

<210> 8

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<212> DNA

<213> Baculovirus

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gccggatcgt acaagtgacc aaac 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 9

gacacggtaa ccgccgctaa ct 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 10

ccgtcaaacg ttacatgctt ttcg 24

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 11

agatggcttt gatagcgctt atattcag 28

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 12

tgtggacgaa aaatcgcagc ag 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 13

ggcaaacagc atccaacaca gc 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 14

ggccgggtaa aattgtcaac agtc 24

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 15

gcgattttat gtcagccatt caactac 27

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

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cgcaatgttt gtaatcatgt cacgc 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 17

aaagaaggca aacccaagtg tgtgt 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 18

gcctaatttc agcatcggga gc 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 19

cgaggtttgc acggctttca c 21

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 20

cacaccacga attatttccc ttcaac 26

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 21

agtggcccgg tgttatatta agtcg 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 22

gtggctcgag atcaatcaat tttcc 25

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 23

aaatttgctg acccatgtct gcg 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 24

acagccttca catacgcctc ttcc 24

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 25

tcctaaacac acggttgagt atgtacatg 29

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 26

gtacaacgtg ccgtttcgag acat 24

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 27

attttggaga cgaggtaatc aacacg 26

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 28

atgtcggaaa gtttgcattg gatg 24

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 29

agcttttatt caaccgagcg tgc 23

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 30

catgacagtg ttcgttttgt cgaatg 26

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 31

tcgttgaaat cttgaaccac gtcc 24

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 32

aaacgctcat gttgtgttcg cc 22

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 33

cacgcgaaat tgtattatcg gcac 24

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 34

tattggttgt gattcttgcc agacg 25

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 35

tcgtagaatt tttcaaatat cctcttaccg 30

<210> 36

<211> 26

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 36

gggcgattca ttatgtgaca acagtc 26

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 37

gagtttcaaa caccagatcg gcg 23

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 38

cgatgtgatt ttggatttta acggag 26

<210> 39

<211> 27

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 39

cttgtttata aacagctttg tcgtcgc 27

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 40

ttactagaca tttcgtcgta ttgttgcct 29

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 41

tatctcacga gatccggctt tcaac 25

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 42

cgttgcgtac agcgactgca tc 22

<210> 43

<211> 28

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 43

tgtatacgat tgatggtcat tgtccttc 28

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 44

cgactcttct aataaactca gtaggcgac 29

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 45

tgtcgtccac gaatctatgc aatgt 25

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 46

gccatcgttt gtgctaaatt cgc 23

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 47

ccagctgctg attgaaaggt aacg 24

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 48

ggaacgtaaa aagttgacat tgtccg 26

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 49

catcgaatgt gatcaatcaa acgtgt 26

<210> 50

<211> 29

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 50

aatataatgt aatagcggtg ttcgacgac 29

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 51

atgacaatag ccaagatccc aacg 24

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 52

ggtagacatt gccgaacaaa cgc 23

<210> 53

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 53

gccttttcag ttgtaattcg tttcagtt 28

<210> 54

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 54

ggttgtattg actttaacag ctcggact 28

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 55

aataagtcgt ttaacacact caatgggc 28

<210> 56

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 56

tacaatagga gaggacaaaa tggaggag 28

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 57

ttgtactgaa caaacgaggg gtgc 24

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 58

caccgaagaa cctgcagaga aacac 25

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 59

gttaatgtat ccagggtcgg tgctc 25

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 60

cgctcagtcg gatgtattac aatgc 25

<210> 61

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 61

gctgtgtttc ctaatatttt ccatcacc 28

<210> 62

<211> 24

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 62

cctcaatctc tccgcttcct gttc 24

<210> 63

<211> 28

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 63

gttgccgaaa tagaaagtaa tctgttgc 28

<210> 64

<211> 31

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 64

catgtatatt ttacgatgat gcaaaaatgt g 31

<210> 65

<211> 27

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 65

aaattttgtg acgtcaatga aacaacg 27

<210> 66

<211> 23

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 66

ttttgcgttc cctcacaatt tgg 23

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 67

aacatcatgc tcgtgcctgt acact 25

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 68

cggttgaata tgaatttgaa cacgg 25

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> baculovirus

<400> 69

ttcggaatgc acacggggat 20

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 70

cttgggtcat gtcgcctgta gtg 23

<210> 71

<211> 27

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 71

ggtacgcata taaaagtttg gagtcgc 27

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 72

ggtgatttga tttcgtttga cagcg 25

<210> 73

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 73

gcatcaatct cccaagcaaa cagg 24

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 74

gacgacacgt ttttgctgat gcc 23

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 75

ccaacgccct tctttgtaga tgct 24

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 76

tatttttttg tcagcgttcc cgtg 24

<210> 77

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 77

caacggtacg ctcaacaatt tgctag 26

<210> 78

<211> 27

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 78

acataaacga cgcagaatac attgacg 27

<210> 79

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 79

cctttccaaa atgttgattg tcgtgt 26

<210> 80

<211> 26

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 80

agcgagttta gttatgagcc atgtgc 26

<210> 81

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 81

ttgtaaagca caatcaaaaa gatgatgtc 29

<210> 82

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 82

ccaacgttta tcattttcct gaatactct 29

<210> 83

<211> 27

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 83

gcatatgtat ggcataccta ctggcat 27

<210> 84

<211> 27

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 84

gcgtgtcaaa ttctaaaatg tccacag 27

<210> 85

<211> 23

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 85

atttgctaga cgatgccgtg ctc 23

<210> 86

<211> 23

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 86

gccctaatgg cgaacacgat aac 23

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 87

cgactgtttt cgtatccgct cac 23

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 88

attagatttt accaacatga cgccg 25

<210> 89

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 89

cctgattagg atacaattta ttgactgcg 29

<210> 90

<211> 29

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 90

aacatttaca tcacatgaac tagcagcag 29

<210> 91

<211> 69

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 91

ttgttaacaa atctaacgaa aagcatgtaa cgtttgacgg ccttaggcta gagtcgacct 60

gcaggcatg 69

<210> 92

<211> 70

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 92

gaatctgttc attgagacga gtattttctt ctatcagctg tcgccttagg cgggtaccga 60

gctcgaattc 70

<210> 93

<211> 69

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 93

ggaaatcaat tgccgttgaa gggaaataat tcgtggtgtg ccttaggcta gagtcgacct 60

gcaggcatg 69

<210> 94

<211> 71

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 94

tgctacaaaa ggtagcctga atataagcgc tatcaaagcc atctccttag gcgggtaccg 60

agctcgaatt c 71

<210> 95

<211> 69

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 95

agaagcgtcg acgaggctgg cgaacacaac atgagcgttt ccttaggcta gagtcgacct 60

gcaggcatg 69

<210> 96

<211> 79

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 96

gtgcaggaag caataaatga ttttaaacga cttaatataa caccgggcca ctccttaggc 60

gggtaccgag ctcgaattc 79

<210> 97

<211> 71

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 97

aagcaagaag agcgtttgaa gatgcagtcg ctgtacgcaa cgccttaggc tagagtcgac 60

ctgcaggcat g 71

<210> 98

<211> 68

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 98

tgatcgttgc gcaacaagtg ccgataatac aatttcgcgt gccttaggcg ggtaccgagc 60

tcgaattc 68

<210> 99

<211> 76

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 99

ttaagcggat acaacgggca gtccgagctg ttaaagtcaa tacaacccct taggctagag 60

tcgacctgca ggcatg 76

<210> 100

<211> 79

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 100

catgaaaaac aaacggcttt aaacgaagga caatgaccat caatcgtata caccttaggc 60

gggtaccgag ctcgaattc 79

<210> 101

<211> 79

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 101

tatatacctc aaaatatttc acatttttgc atcatcgtaa aatatacatg ccttaggcta 60

gagtcgacct gcaggcatg 79

<210> 102

<211> 70

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 102

tgagaccgtt caatggccca ttgagtgtgt taaacgactt attccttagg cgggtaccga 60

gctcgaattc 70

<210> 103

<211> 69

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 103

ccggcggatt ggtgcacggc atcagcaaaa acgtgtcgtc ccttaggcta gagtcgacct 60

gcaggcatg 69

<210> 104

<211> 79

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 104

cttaaatatt gtaaaaaata ttacacgttg tttcattgac gtcacaaaat ttccttaggc 60

gggtaccgag ctcgaattc 79

<210> 105

<211> 79

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 105

ttcaaagtaa tacatgaatt tagagtattc aggaaaatga taaacgttgg ccttaggcta 60

gagtcgacct gcaggcatg 79

<210> 106

<211> 67

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 106

taattgctac aacaacagca tctacaaaga agggcgttgg ccttaggcgg gtaccgagct 60

cgaattc 67

<210> 107

<211> 73

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 107

tttatgccgg aacttctgct gctagttcat gtgatgtaaa tgttccttag gctagagtcg 60

acctgcaggc atg 73

<210> 108

<211> 70

<212> DNA

<213> Baculovirus

<400> 108

gccgtcgatt taactaatgc cagtaggtat gccatacata tgcccttagg cgggtaccga 60

gctcgaattc 70

<210> 109

<211> 11527

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

gcattccggc tggtcgctaa tcgttgagtg cattggtgac ttacacatag acgaccatca 60

caccactgaa gactgcggga ttgctctcgg tcaagctttt aaagaggccc taggggccgt 120

gcgtggagta aaaaggtttg gatcaggatt tgcgcctttg gatgaggcac tttccagagc 180

ggtggtagat ctttcgaaca ggccgtacgc agttgtcgaa cttggtttgc aaagggagaa 240

agtaggagat ctctcttgcg agatgatccc gcattttctt gaaagctttg cagaggctag 300

cagaattacc ctccacgttg attgtctgcg aggcaagaat gatcatcacc gtagtgagag 360

tgcgttcaag gctcttgcgg ttgccataag agaagccacc tcgcccaatg gtaccaacga 420

tgttccctcc accaaaggtg ttcttatgta gtgacaccga ttatttaaag ctgcagcata 480

cgatatatat acatgtgtat atatgtatac ctatgaatgt cagtaagtat gtatacgaac 540

agtatgatac tgaagatgac aaggtaatgc atcattctat acgtgtcatt ctgaacgagg 600

cgcgctttcc ttttttcttt ttgctttttc tttttttttc tcttgaactc gacggatcta 660

tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtcg ctagtgataa taagtgactg aggtatgtgc 720

tcttcttatc tccttttgta gtgttgctct tattttaaac aactttgcgg ttttttgatg 780

actttgcgat tttgttgttg ctttgcagta aattgcaaga tttaataaaa aaacgcaaag 840

caatgattaa aggatgttca gaatgaaact catggaaaca cttaaccagt gcataaacgc 900

tggtcatgaa atgacgaagg ctatcgccat tgcacagttt aatgatgaca gcccggaagc 960

gaggaaaata acccggcgct ggagaatagg tgaagcagcg gatttagttg gggtttcttc 1020

tcaggctatc agagatgccg agaaagcagg gcgactaccg cacccggata tggaaattcg 1080

aggacgggtt gagcaacgtg ttggttatac aattgaacaa attaatcata tgcgtgatgt 1140

gtttggtacg cgattgcgac gtgctgaaga cgtatttcca ccggtgatcg gggttgctgc 1200

ccataaaggt ggcgtttaca aaacctcagt ttctgttcat cttgctcagg atctggctct 1260

gaaggggcta cgtgttttgc tcgtggaagg taacgacccc cagggaacag cctcaatgta 1320

tcacggatgg gtaccagatc ttcatattca tgcagaagac actctcctgc ctttctatct 1380

tggggaaaag gacgatgtca cttatgcaat aaagcccact tgctggccgg ggcttgacat 1440

tattccttcc tgtctggctc tgcaccgtat tgaaactgag ttaatgggca aatttgatga 1500

aggtaaactg cccaccgatc cacacctgat gctccgactg gccattgaaa ctgttgctca 1560

tgactatgat gtcatagtta ttgacagcgc gcctaacctg ggtatcggca cgattaatgt 1620

cgtatgtgct gctgatgtgc tgattgttcc cacgcctgct gagttgtttg actacacctc 1680

cgcactgcag tttttcgata tgcttcgtga tctgctcaag aacgttgatc ttaaagggtt 1740

cgagcctgat gtacgtattt tgcttaccaa atacagcaat agcaatggct ctcagtcccc 1800

gtggatggag gagcaaattc gggatgcctg gggaagcatg gttctaaaaa atgttgtacg 1860

tgaaacggat gaagttggta aaggtcagat ccggatgaga actgtttttg aacaggccat 1920

tgatcaacgc tcttcaactg gtgcctggag aaatgctctt tctatttggg aacctgtctg 1980

caatgaaatt ttcgatcgtc tgattaaacc acgctgggag attagataat gaagcgtgcg 2040

cctgttattc caaaacatac gctcaatact caaccggttg aagatacttc gttatcgaca 2100

ccagctgccc cgatggtgga ttcgttaatt gcgcgcgtag gagtaatggc tcgcggtaat 2160

gccattactt tgcctgtatg tggtcgggat gtgaagttta ctcttgaagt gctccggggt 2220

gatagtgttg agaagacctc tcgggtatgg tcaggtaatg aacgtgacca ggagctgctt 2280

actgaggacg cactggatga tctcatccct tcttttctac tgactggtca acagacaccg 2340

gcgttcggtc gaagagtatc tggtgtcata gaaattgccg atgggagtcg ccgtcgtaaa 2400

gctgctgcac ttaccgaaag tgattatcgt gttctggttg gcgagctgga tgatgagcag 2460

atggctgcat tatccagatt gggtaacgat tatcgcccaa caagtgctta tgaacgtggt 2520

cagcgttatg caagccgatt gcagaatgaa tttgctggaa atatttctgc gctggctgat 2580

gcggaaaata tttcacgtaa gattattacc cgctgtatca acaccgccaa attgcctaaa 2640

tcagttgttg ctcttttttc tcaccccggt gaactatctg cccggtcagg tgatgcactt 2700

caaaaagcct ttacagataa agaggaatta cttaagcagc aggcatctaa ccttcatgag 2760

cagaaaaaag ctggggtgat atttgaagct gaagaagtta tcactctttt aacttctgtg 2820

cttaaaacgt catctgcatc aagaactagt ttaagctcac gacatcagtt tgctcctgga 2880

gcgacagtat tgtataaggg cgataaaatg gtgcttaacc tggacaggtc tcgtgttcca 2940

actgagtgta tagagaaaat tgaggccatt cttaaggaac ttgaaaagcc agcaccctga 3000

tgcgacctcg ttttagtcta cgtttatctg tctttactta atgtcctttg ttacaggcca 3060

gaaagcataa ctggcctgaa tattctctct gggcccactg ttccacttgt atcgtcggtc 3120

tgataatcag actgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggga 3180

ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccacggt cccactcgta 3240

tcgtcggtct gataatcaga ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg tctgattatt 3300

agtctgggac catggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg gaccacggtc 3360

ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tggaaccacg gtcccactcg tatcgtcggt 3420

ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc ggtctgatta ttagtctggg 3480

accacgatcc cactcgtgtt gtcggtctga ttatcggtct gggaccacgg tcccacttgt 3540

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attgacatgt cgtcgtaacc tgtagaacgg agtaacctcg gtgtgcggtt gtatgcctgc 3660

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gtcataattg attatttgac gtggtttgat ggcctccacg cacgttgtga tatgtagatg 3960

ataatcatta tcactttacg ggtcctttcc ggtgatccga caggttacgg ggcggcgacc 4020

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cataacttaa tgtttttatt taaaataccc tctgaaaaga aaggaaacga caggtgctga 4140

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ccaatattta taaaccttgt ttttaaccag ggctgcgccc tgtgcgcgtg accgcgcacg 8640

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tccacttatc cacggggata tttttataat tatttttttt atagttttta gatcttcttt 8820

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