1.一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:具体步骤为:
(一)、全细胞肿瘤抗原制备:
(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个,悬浮于1ml PBS中,得到细胞悬液;
(2)、将细胞悬液置于40-43℃恒温水浴锅中,处理1h;
(3)、水浴锅中取出细胞悬液,立即放到-75--85℃超低温冰箱中,1h之后,转入37℃水浴锅中,轻轻摇晃,至完全融化,再次放入-75--85℃超低温冰箱中,如此反复3次;
(4)、在12000rpm的条件下,离心10min;
(5)、取上清,即为热休克肿瘤细胞冻融抗原,并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液,去除杂质后,将上清液置于-75--85℃超低温冰箱中保存备用;
(二)、DC细胞制备:
(6)、取自体外周血100ml于血袋中,在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中,每管15ml,在2000rpm的条件下,离心15-25min;
(7)、离心结束后,吸取黄色透明层上的白膜层,再用生理盐水重悬于50ml离心管中,离心3-8min,弃上清,如此反复两次;
(8)、将细胞重悬于10ml的GT-T551培养基中,然后装于T75培养瓶中,在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育2h;
(9)、吸弃悬浮液,DC细胞贴壁,再加入40ml GT-T551培养基培养,隔天换一次培养液;
(三)、DC瘤苗制备:
(10)、DC细胞培养第6天,将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h;
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时,诱导DC细胞成熟;
(12)、在上述细胞液中加入LPS,使浓度为1μg/ml,孵育24h,以增强DC细胞表达共刺激分子,分泌IL-12p70;
(13)、第8天,细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞,收集到50ml离心管中,2000rpm,5min离心;
(14)、弃上清,并重悬上述DC细胞于生理盐水中,离心3-8min,弃上清,重复两次,即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。
2.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:所述的步骤(7)中,离心速度为1500rpm。
3.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:所述的步骤(8)中,所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素和50μg/ml的两性霉素B。
4.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:所述的步骤(9)中,所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素、5%(v/v)灭活人AB血清、50μg/ml两性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
5.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:所述的步骤(10)中,DC细胞与肿瘤细胞的浓度比在5:1-10:1之间,其中冻融抗原H520:H522=1:1。
6.根据权利要求1所述的一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法,其特征在于:所述的步骤(14)中,离心速度为1500rpm。