本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法。
背景技术：
肺癌发生于支气管黏膜上皮，近50年来肺癌的发病率显著增高，在欧美工业发达国家和我国的一些工业大城市中，肺癌发病率在男性恶性肿瘤中已居首位，在女性发病率也迅速增高，占女性常见恶性肿瘤的第2位或第3位。肺癌成为危害生命健康的一种主要疾病,肺癌通常分为两种：非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)约占80±85％，小细胞肺癌(small cell carcinoma，SCC),约占15±20％。
非小细胞肺癌主要有三种亚型，包括腺癌(50％)、鳞癌(30％)、大细胞癌(5％),尽管手术、放疗、化疗的技术在不断进步，但25年来，其五年期生存率也仅从5％提高到15％,因此开发一种新的治疗方法也就尤为必要。
肿瘤疫苗是肿瘤生物治疗的重要组成部分，近年来发展迅速，为肿瘤的预防和治疗开辟了新的途径,肿瘤疫苗原理是利用肿瘤抗原激发机体自身的免疫保护机制，达到全身性的特异性抗肿瘤作用,与现有治疗方法相比，肿瘤疫苗毒副作用小，特异性高，作用范围广，在阻止肿瘤扩散，防止复发等方面逐渐展现出其功效。
树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内功能最强的抗原提呈细胞，能有效摄取、加工肿瘤抗原，表达高水平MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ类分子及CD54、CD80、CD86等多中共刺激分子，并分泌多种细胞因子如IL-12p70，诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞，也促进了体液免疫，在机体抗肿瘤免疫中发挥着重要作用。
目前DC瘤苗负载的抗原主要有：肿瘤相关抗原肽(TAA)、肿瘤全细胞裂解物、凋亡细胞等,关于小细胞肺癌瘤苗制备方面，目前还主要在研究和探索阶段，目前还未找到有效激发免疫应答的肺癌特异性抗原,因此选择何种相关抗原并以何种手段刺激活化DC，从而增强患者免疫状态，成为免疫治疗的关键问题。体外研究表明，体外培养、扩增DC，并用肿瘤的裂解物致敏DC回输体内，可有效诱发机体的特异性抗肿瘤免疫应答,该方法简单易行，无需明确肿瘤抗原，回避了鉴定肿瘤特异性抗原的困难，可以激发针对多个已知或未知的肿瘤相关抗原的T细胞免疫，减少了肿瘤逃逸的可能性，且因其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子，同时启动广泛的Th1和CTL的免疫反应，可诱发多重免疫反应。
同时近年来研究发现，肿瘤细胞在热休克过程中能大量产生热休克蛋白(HSP70、HSP90、钙网蛋白等)，HSP已被证明其作为一种免疫佐剂能有效地增强免疫反应,因此，经过热休克的肿瘤细胞裂解物能更有效的致敏DC细胞,此外,研究表明，细菌脂多糖(LPS)刺激DC细胞后可增强DC细胞表面表达共刺激分子、促进其分泌细胞因子等，故其可以用来增强DC的抗原提成功能，增强免疫效应。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的副作用大、效果比较差的缺陷，提供一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法来解决上述问题。
本发明公开了一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，具体步骤为：
(一)、全细胞肿瘤抗原制备：
(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个，悬浮于1ml PBS中，得到细胞悬液；
(2)、将细胞悬液置于40-43℃恒温水浴锅中，处理1h；
(3)、水浴锅中取出细胞悬液，立即放到-75--85℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低温冰箱中，如此反复3次；
(4)、在12000rpm的条件下，离心10min；
(5)、取上清，即为热休克肿瘤细胞冻融抗原，并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液，去除杂质后，将上清液置于-75--85℃超低温冰箱中保存备用；
(二)、DC细胞制备：
(6)、取自体外周血100ml于血袋中，在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，每管15ml，在2000rpm的条件下，离心15-25min；
(7)、离心结束后，吸取黄色透明层上的白膜层，再用生理盐水重悬于50ml离心管中，离心3-8min，弃上清，如此反复两次；
(8)、将细胞重悬于10ml的GT-T551培养基中，然后装于T75培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育2h；
(9)、吸弃悬浮液，DC细胞贴壁，再加入40ml GT-T551培养基培养，隔天换一次培养液；
(三)、DC瘤苗制备：
(10)、DC细胞培养第6天，将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时，诱导DC细胞成熟；
(12)、在上述细胞液中加入LPS，使浓度为1μg/ml，孵育24h，以增强DC细胞表达共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞，收集到50ml离心管中，2000rpm，5min离心；
(14)、弃上清，并重悬上述DC细胞于生理盐水中，离心3-8min，弃上清，重复两次，即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。
作为优选，所述的步骤(7)中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤(8)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素和50μg/ml的两性霉素B。
作为优选，所述的步骤(9)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素、5％(v/v)灭活人AB血清、50μg/ml两性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作为优选，所述的步骤(10)中，DC细胞与肿瘤细胞的浓度比在5:1-10:1之间，其中冻融抗原H520:H522＝1:1。
作为优选，所述的步骤(14)中，离心速度为1500rpm。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明采用非小细胞肺癌全细胞裂解物作为抗原致敏DC细胞；
2、本发明选用两种非小细胞肺癌细胞系分别为H520和H522，且其比例为H520:H522＝1:1；
3、本发明采用热休克方法，促使肿瘤细胞产生热休克蛋白。
4、本发明DC细胞来源于自体外周血，通过体外培养，获得大量DC细胞，无毒副作用。
5、本发明采用多聚肌苷酸(Poly(I:C))诱导DC细胞成熟，其浓度为25μg/ml。
6、本发明使用LPS刺激DC细胞，增强免疫反应，免疫效果好。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，具体步骤为：
(一)、全细胞肿瘤抗原制备：
(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个，悬浮于1ml PBS中，得到细胞悬液；
(2)、将细胞悬液置于40-43℃恒温水浴锅中，处理1h；
(3)、水浴锅中取出细胞悬液，立即放到-75--85℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低温冰箱中，如此反复3次；
(4)、在12000rpm的条件下，离心10min；
(5)、取上清，即为热休克肿瘤细胞冻融抗原，并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液，去除杂质后，将上清液置于-75--85℃超低温冰箱中保存备用；
(二)、DC细胞制备：
(6)、取自体外周血100ml于血袋中，在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，每管15ml，在2000rpm的条件下，离心15-25min；
(7)、离心结束后，吸取黄色透明层上的白膜层，再用生理盐水重悬于50ml离心管中，离心3-8min，弃上清，如此反复两次；
(8)、将细胞重悬于10ml的GT-T551培养基中，然后装于T75培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育2h；
(9)、吸弃悬浮液，DC细胞贴壁，再加入40ml GT-T551培养基培养，隔天换一次培养液；
(三)、DC瘤苗制备：
(10)、DC细胞培养第6天，将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时，诱导DC细胞成熟；
(12)、在上述细胞液中加入LPS，使浓度为1μg/ml，孵育24h，以增强DC细胞表达共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞，收集到50ml离心管中，2000rpm，5min离心；
(14)、弃上清，并重悬上述DC细胞于生理盐水中，离心3-8min，弃上清，重复两次，即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。
作为优选，所述的步骤(7)中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤(8)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素和50μg/ml的两性霉素B。
作为优选，所述的步骤(9)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素、5％(v/v)灭活人AB血清、50μg/ml两性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作为优选，所述的步骤(10)中，DC细胞与肿瘤细胞的浓度比在5:1-10:1之间，其中冻融抗原H520:H522＝1:1。
作为优选，所述的步骤(14)中，离心速度为1500rpm。
实施例1
本发明公开了一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，具体步骤为：
(一)、全细胞肿瘤抗原制备：
(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个，悬浮于1ml PBS中，得到细胞悬液；
(2)、将细胞悬液置于42℃恒温水浴锅中，处理1h；
(3)、水浴锅中取出细胞悬液，立即放到-80℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入-80℃超低温冰箱中，如此反复3次；
(4)、在12000rpm的条件下，离心10min；
(5)、取上清，即为热休克肿瘤细胞冻融抗原，并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液，去除杂质后，将上清液置于-80℃超低温冰箱中保存备用；
(二)、DC细胞制备：
(6)、取自体外周血100ml于血袋中，在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，每管15ml，在2000rpm的条件下，离心20min；
(7)、离心结束后，吸取黄色透明层上的白膜层，再用生理盐水重悬于50ml离心管中，离心5min，弃上清，如此反复两次；
(8)、将细胞重悬于10ml的GT-T551培养基中，然后装于T75培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育2h；
(9)、吸弃悬浮液，DC细胞贴壁，再加入40ml GT-T551培养基培养，隔天换一次培养液；
(三)、DC瘤苗制备：
(10)、DC细胞培养第6天，将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时，诱导DC细胞成熟；
(12)、在上述细胞液中加入LPS，使浓度为1μg/ml，孵育24h，以增强DC细胞表达共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞，收集到50ml离心管中，2000rpm，5min离心；
(14)、弃上清，并重悬上述DC细胞于生理盐水中，离心5min，弃上清，重复两次，即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。
作为优选，所述的步骤(7)中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤(8)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素和50μg/ml的两性霉素B。
作为优选，所述的步骤(9)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素、5％(v/v)灭活人AB血清、50μg/ml两性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作为优选，所述的步骤(10)中，DC细胞与肿瘤细胞的浓度比在5:1-10:1之间，其中冻融抗原H520:H522＝1:1。
作为优选，所述的步骤(14)中，离心速度为1500rpm。
实施例2
本发明公开了一种非小细胞肺癌全细胞抗原树突状细胞瘤苗的制备方法，具体步骤为：
(一)、全细胞肿瘤抗原制备：
(1)、分别取对数生长期的小细胞肺癌细胞系H520和H522各2×106个，悬浮于1ml PBS中，得到细胞悬液；
(2)、将细胞悬液置于40℃恒温水浴锅中，处理1h；
(3)、水浴锅中取出细胞悬液，立即放到-75℃超低温冰箱中，1h之后，转入37℃水浴锅中，轻轻摇晃，至完全融化，再次放入-80℃超低温冰箱中，如此反复3次；
(4)、在12000rpm的条件下，离心10min；
(5)、取上清，即为热休克肿瘤细胞冻融抗原，并用0.2μm孔径过滤器过滤上清液，去除杂质后，将上清液置于-75℃超低温冰箱中保存备用；
(二)、DC细胞制备：
(6)、取自体外周血100ml于血袋中，在无菌条件下分装于含有15ml淋巴细胞分离液的离心管中，每管15ml，在2000rpm的条件下，离心15min；
(7)、离心结束后，吸取黄色透明层上的白膜层，再用生理盐水重悬于50ml离心管中，离心8min，弃上清，如此反复两次；
(8)、将细胞重悬于10ml的GT-T551培养基中，然后装于T75培养瓶中，在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育2h；
(9)、吸弃悬浮液，DC细胞贴壁，再加入40ml GT-T551培养基培养，隔天换一次培养液；
(三)、DC瘤苗制备：
(10)、DC细胞培养第6天，将冻融抗原加入DC细胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小时，诱导DC细胞成熟；
(12)、在上述细胞液中加入LPS，使浓度为1μg/ml，孵育24h，以增强DC细胞表达共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，细胞刮子从培养瓶底部刮起肿瘤细胞，收集到50ml离心管中，2000rpm，5min离心；
(14)、弃上清，并重悬上述DC细胞于生理盐水中，离心3min，弃上清，重复两次，即制成负载全细胞抗原的DC瘤苗。
作为优选，所述的步骤(7)中，离心速度为1500rpm。
作为优选，所述的步骤(8)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素和50μg/ml的两性霉素B。
作为优选，所述的步骤(9)中，所述的GT-T551培养基中含有40U/ml的硫酸庆大霉素、5％(v/v)灭活人AB血清、50μg/ml两性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作为优选，所述的步骤(10)中，DC细胞与肿瘤细胞的浓度比在5:1-10:1之间，其中冻融抗原H520:H522＝1:1。
作为优选，所述的步骤(14)中，离心速度为1500rpm。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。