智利江蓠原生质体的制备方法与流程

本发明涉及一种智利江蓠原生质体的制备方法，属于藻类细胞工程领域。

背景技术：

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的细胞，其结构包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分。原生质体技术是指在原生质体的分离培养基础上进行的一系列技术操作，主要包括原生质体植株再生、原生质体融合和细胞杂交、转基因等培育变异新类型的生物技术等。原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广、可行性强等优点，是植物生物工程的基础。

植物原生质体制备包括材料的选择和预处理，组织分解和原生质体初步游离以及原生质体的纯化和活力检测。选择适宜的材料是成功分离原生质体的基础；酶解或机械处理前对于材料的预处理可以提高破壁效率并减少原生质的损伤；合理的酶制剂的选择以及浓度的调节、渗透压调节剂的选择都是提高原生质产量及活性的关键。虽然近年来对于原生质的培养技术取得了迅速的发展，但是还存在原生质体活力不高，培养周期长等问题。

智利江蓠(Gracilaria chilensis)具有生长快、耐高温的特性，是南方潜在的养殖品种之一。目前，江蓠主要通过营养生殖的方式进行繁殖。苗种的繁育受温度、海水盐度等环境因子的影响极大，极具不稳定性。原生质体具有全能性，在人工控制的条件下可大量快速繁殖，可以缓解苗种的繁育压力。此外，江蓠的细胞壁中含有较厚的胶质物，无法直接进行细胞融合、细胞杂交等遗传操作，利用现有技术中常规的的酶溶解手段获得的原生质体往往活性较低，产量也不理想。

专利CN2016101618265公开了一种缢江蓠原生质体的制备方法，其通过采用鲍消化腺酶液对缢江蓠组织进行酶解，从而制备原生质体。但本发明发现源自鲍消化组织的酶液对智利江蓠组织的酶解效果不佳。

技术实现要素：

本发明的目的是提供智利江蓠原生质体的制备方法。同时，根据海藻体细胞发育的全能性，利用工具酶分解智利江蓠组织，游离出体细胞原生质体，也可为遗传工程研究提供理想受体系统。

在一个实施方案中，所述制备方法包括组织酶液制备、智利江蓠组织酶解等步骤，所述组织酶液制备步骤为：将其用1-10倍海参肠体积的海水0℃匀浆破碎；在4℃下浸提4-18h，然后将浸提液调pH值至7.0-8.0，冷冻离心5min，取上层清液即得海参酶液；将海参酶液、纤维素酶和海水混合后即得组织酶液。

在一个具体实施方案中，所述组织酶液制备步骤为：将其用2倍海参肠体积的海水0℃匀浆破碎；在4℃下浸提12h，然后将浸提液调pH值至7.6，冷冻离心5min，取上层清液即得海参酶液；将海参酶液、纤维素酶和海水混合后即得组织酶液。

在进一步地实施方案中，所述组织酶液的具体组成为2.4ml纤维素酶、0.5ml海参酶液和17.1ml消毒海水。

在另一个实施方案中，所述智利江蓠组织酶解步骤为取智利江蓠组织用解剖刀将藻体切碎，加入制备好的组织酶液进行酶解，然后用200目的筛绢进行过滤，去除未消化的细胞、细胞团和碎片，去上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水进行冲洗离心2-3次，收集沉淀后悬浮至2ml，即得原生质体。

在一个实施方案中，所述酶解条件为添加组织酶液的藻体组织放入25℃的恒温摇床上进行黑暗酶解5h。

附图说明

图1：原生质体的荧光检测图(×20倍)左：原生质体；右：荧光染色后的原生质体，显示红色

图2：原生质体培养12天后的显微镜图

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

实施例1

组织酶液制备：将其用2倍海参肠体积的海水0℃匀浆破碎；在4℃下浸提12h，然后将浸提液调pH值至7.6，冷冻离心5min，取上层清液即得海参酶液；将海参酶液、纤维素酶和海水混合后即得组织酶液。所述组织酶液的具体组成为2.4ml纤维素酶、0.5ml海参酶液和17.1ml消毒海水。

原生质体的制备：取2g智利江篱材料，用吸水纸吸干后用解剖刀将藻体切碎(越碎越好)，加入制备好的组织酶液，放入25℃的恒温摇床上进行黑暗酶解。每30min镜检一次，观察并拍照。5h后，用200目的筛绢进行过滤，去除未消化的细胞、细胞团和碎片，去上清液离心，800rpm离心10min，使单细胞原生质体下沉，细胞碎片留在上清液中，弃去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水进行冲洗离心2-3次，收集沉淀后悬浮至2ml，即得原生质体。

实施例2

原生质体的检测：

细胞密度的测定：用血球计数板进行细胞密度的测定

具体结果如下：

对比例1为组织酶液中海参酶液的制备方法为其用2倍海参肠体积的海水0℃匀浆破碎；在4℃下浸提12h，然后将浸提液调pH值至7.0，冷冻离心5min，取上层清液即得海参酶液；其他组织酶液及原生质体制备方法同本发明实施例1.

对比例2为组织酶液中海参酶液的制备方法为其用2倍海参肠体积的海水0℃匀浆破碎；在4℃下浸提12h，然后将浸提液调pH值至8.0，冷冻离心5min，取上层清液即得海参酶液；其他组织酶液及原生质体制备方法同本发明实施例1.

对比例3为组织酶液的组成为2.4ml纤维素酶、0.5ml鲍鱼酶液和17.1ml消毒海水；鲍鱼酶液制备方法参见专利CN2016101618265说明书中的实施例1，其他组织酶液及原生质体制备方法同本发明实施例1.

对比例4为组织酶液的具体组成为2.0ml纤维素酶、0.9ml海参酶液和17.1ml消毒海水，其他组织酶液及原生质体制备方法同本发明实施例1。

对比例5为组织酶液的具体组成为2.7ml纤维素酶、0.2ml海参酶液和17.1ml消毒海水，其他组织酶液及原生质体制备方法同本发明实施例1。

存活率测定：用0.5％Evans Blue染色，活的原生质体呈亮黄色，死细胞呈深蓝色。在显微镜下随机选择5个视野，计算活原生质体的存活比率，具体结果如下：

实施例3

收集实施例1制备的原生质体在高渗海水中进行弱光培养，光照强度为100-200lx，原生质体再生壁后，逐步降低海水渗透压至普通海水，光照强度逐步增加至3000lx进行培养。

如图2所示，培养42小时后，原生质体还未形成完整的细胞壁，培养4天后，多数原生质体已经再生细胞壁。培养7天后，已经分裂成多个细胞，细胞排列较规则，培养12天后，细胞数不断增加，且排列成不同的形状。

本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。