本发明属于血液样本处理领域，特别涉及一种从血液样本中富集丝状真菌的方法。
背景技术：
随着社会人口老龄化进程加快，使罹患老年性慢性疾病的人群增加，同时，广谱抗生素广泛使用，导管介入性治疗、组织活检等侵入性医疗操作增多，以及肿瘤、艾滋病、白血病、器官移植等免疫力低下患者的数量不断扩大。因此，近年来，深部真菌感染的发病率大幅增加，特别是深部丝状真菌感染的发病率正逐年明显增加，在某些特定人群中其发病率甚至高于酵母菌感染率。由于深部真菌感染早期缺乏特征性的临床症状，难以在发病早期获得病原学诊断，当患者出现持续高热而抗生素治疗数日无效时，往往提示真菌感染已经扩散到数个器官，错过抢救患者的最佳时机；临床实践表明，不同真菌对抗真菌药物的敏感性存在较大差异，甚至部分真菌对常用抗真菌药物天然耐药或不敏感，致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此，及时、正确地诊断深部真菌感染、尤其是丝状真菌感染，对成功抢救患者生命，具有非常重要的现实意义。
现行临床实验室真菌检测方法相对滞后。诊断深部真菌感染的传统方法有形态学、组织病理学、血清学等方法。形态学检查包括真菌直接镜检和培养，是目前丝状真菌病诊断的最常用的方法。但，从血培养阳性的血液培养瓶转种平板至培养出丝状真菌典型菌落，一般需要3天至2周，甚至更长时间。
分子生物学技术以其灵敏度高、特异性强等优点，近年得到飞速发展，现有检测真菌感染的分子生物学方法也日益成熟，如核酸测序，基因芯片，以及采用质谱技术直接鉴定真菌。因此，从血液样本中直接富集和分离丝状真菌，采用分子生物学方法进行直接检测，而不再依赖于转种沙保弱平板获取真菌纯培养，是目前临床微生物学实验室研究的热点。然而，丝状真菌在血液中形成纤细的菌丝，且在患者循环血液中含量很少，生长缓慢。菌丝与细菌或真菌孢子不同，采用同样的实验条件，很难有效地从血液中高效地富集、分离出这类菌丝。
目前临床常用血液样本消化处理液中，溶血剂多为氯化铵、醋酸铵等为有毒或微毒物品，如刺激皮肤、粘膜、眼睛、鼻腔、咽喉，损伤眼睛；高浓度刺激肺，可导致肺积水；而且，血液样本中存在较高浓度蛋白质，甚至有淋巴细胞在血液培养瓶中继续生长、繁殖，氯化铵、醋酸铵容易引起蛋白质沉淀，使溶液浑浊，粘滞度增加，不利于丝状真菌的分离。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种从血液样本中富集丝状真菌的方法，该方法富集真菌菌丝效率高，富集到的真菌杂质少，可用于真菌核酸提取，亦可用于质谱技术直接鉴定真菌，具有广阔的应用空间。
本发明的一种从血液样本中富集丝状真菌的方法，包括：
(1)从血液培养阳性培养瓶中抽取1-2ml血液样本，注入离心管；
(2)向离心管中加入50-150mg石英砂(AR级，25-50目)和10-20ml富集稀释液，混匀，静置，离心得到沉淀；其中，富集稀释液由体积比为10-30:1的80-200g/L尿素溶液(使用前配制)和500-600mM EDTA(pH 8.0)组成；
(3)将沉淀震荡，离心，随后加入十二烷基硫酸钠SDS溶液和灭菌蒸馏水，震荡，除去石英砂；离心，洗涤，即得富集的丝状真菌。
所述步骤(2)中的静置时间为5-10min。
所述步骤(3)中的十二烷基硫酸钠SDS溶液的浓度为0.5％-10％，与沉淀的体积比为1:10-15。
所述步骤(3)中的灭菌蒸馏水与沉淀的体积比为1:0.5-1。
所述步骤(3)中的洗涤具体为采用1.5ml灭菌蒸馏水洗涤3次。
所述步骤(2)和(3)中的离心速度为12000r/min，离心时间为1-2min。
本发明的特点在于：
高浓度尿素溶液不仅能够溶解红细胞、白细胞等血液有型成分，而且能够使红细胞溶解后释放的血红蛋白迅速变性、与细胞碎片一起溶解而不形成沉淀,使溶液更加清亮，粘滞性小，有利于菌丝的沉淀富集。加入少量石英砂，有利于进一步机械性粉碎残存的白细胞、血小板碎片，使其溶解除去，使离心沉淀中杂质更少；同时，在首次离心除去上清液中大量杂质时，石英砂为菌丝提供更多附着表面，减少离心洗涤过程中菌丝的丢失。而加入低浓度的SDS，为阴离子表面活性剂，具有强烈的除垢效果，有助于丝状真菌菌丝从石英砂上洗脱，也有助于除去沉淀中可能残存的尿素。实验表明，真菌的细胞壁非常坚韧，在加入石英砂的条件下，酵母样真菌的孢子在高速震荡器需要连续震荡约10min、丝状真菌菌丝需要连续震荡20-25min才能有效破壁释出核酸。因此，在本发明的实验条件下，不会引起真菌菌丝或孢子裂解。
特别是，对于真菌重症血流感染患者，采用本发明的方法，通过多管法(3-5个富集管)，以增加用于富集真菌的血液标本量至6-10ml，将富集到的真菌合并，不经过血液培养，而是从患者外周血液中直接富集真菌，然后，采用分子生物学方法，也可以对血液样本中的真菌进行检测。本发明富集的真菌杂质少，可以直接用于真菌核酸提取。
有益效果
本发明不仅能够高效破坏血液有型成分，而且能够使红细胞溶解后释放的血红蛋白迅速变性、溶解,使富集稀释液更加清亮，粘滞性小，有利于从血液样本中富集微量丝状真菌菌丝，从而显著提高从血液样本中分离、检测丝状真菌的阳性率；本发明富集真菌菌丝效率高，富集到的真菌杂质少，可用于真菌核酸提取，亦可用于质谱技术直接鉴定真菌，具有广阔的应用空间。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、样本准备：
由于丝状真菌血培养阳性血液样本在临床短期内难以找到足够数量，而标本保存时间过久或不是在同一时间进行检测，对实验结果分析可能产生影响。本实施例采用模拟临床标本进行实验：
1.选择经测序方法鉴定为白酵母菌和黑曲霉菌的临床分离株作为实验对象，分别取沙保弱培养基上两种真菌菌落/菌丝，以RPMI1640培养基研磨、稀释，以Marienfeld血球计数板分别对其中的孢子/菌丝进行计数，以调节两种真菌的孢子/菌丝浓度为1000CFU/ml。
2.取健康志愿者血液约150ml，分A、B两组，每组50ml血液，向A组血液中加入孢子浓度为1000CFU/ml白酵母菌菌液250μl；向B组血液中加入菌丝浓度为1000CFU/ml黑曲霉菌液250μl。将血液样本充分混匀，此时，血液样本中真菌孢子/菌丝的浓度约为5CFU/ml。
3.将每组血液样本按照每瓶5ml分别注入10个Bact/ALERT血培养瓶。同时，取5ml未加入菌液的血液注入血培养瓶作为对照瓶。血培养瓶放入3D全自动血培养仪，待仪器提示培养阳性后取出，最后1瓶测试瓶报阳后与对照瓶一起取出；培养瓶中血液样本充分混匀后(特别是黑曲霉培养测试瓶)，每瓶取3-5ml作为测试血液样本，对照瓶继续培养至14天。
二、真菌富集过程：
1.向预加入100mg石英砂的25ml无菌有盖离心管加入1ml血液样本，加入富集稀释液20ml(100g/L尿素溶液与500mM EDTA按照体积比20:1混合)，混匀，静置10min。
2.12000r/min离心2min，从上方小心移除上清液，留约1.5ml沉淀。
3.沉淀在高速振荡器震荡1min，以20ml灭菌蒸馏水12000r/min离心1min，弃上清液。
4.向管内沉淀加入0.1ml 5％SDS溶液和1.4ml灭菌蒸馏水，震荡0.5min，将管内液体全部转入1.5ml管内，弃去石英砂。
5.12000r/min离心1min，弃上清液，再用1.5ml灭菌蒸馏水12000r/min离心1min，洗涤3次，弃上清液，沉淀即为从血液样本中富集的丝状真菌。
三、真菌富集结果检测方法：
沉淀中加入1ml灭菌蒸馏水，充分混匀，取0.1ml涂片，干燥后革兰染色镜检，计数全片中真菌菌丝/孢子数量。
四、实验结果：
1.在血液样本培养开始后的前3天内，20瓶测试培养瓶仪器全部报阳，而对照瓶继续培养至14天仍未报阳；
2.真菌菌丝/孢子计数结果见下表；
A组10个样本中，0.1ml沉淀中检出到白酵母菌孢子最多250个，最少136个，平均182个，相当于每1ml血液样本中富集到1820个真菌孢子；B组10个样本中，0.1ml沉淀中检出黑曲霉菌丝最多264条，最少102条，平均204条，相当于每1ml血液样本中富集到2040条真菌菌丝；两组样本富集的真菌均满足真菌核酸提取或质谱技术进行真菌鉴定对菌量的最低要求。