一种内生真菌对穿心莲内酯二萜类物质的转化应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株来自植物穿心莲的内生真菌对穿心莲内酯二萜类物质的转化应用。

背景技术：

新穿心莲内酯(Neoandrographolide)是一种常见的穿心莲二萜内酯。现代药理研究表明：新穿心莲内酯具有抗炎、抗病毒、抗自由基、抗HIV病毒及保肝作用。由于其难溶于水，通常仅能口服给药，影响了制剂的发展，因此有必要对新穿心莲内酯进行结构改造，以发掘结构新颖的穿心莲二萜内酯类衍生物，研究其生物活性和应用途径，为穿心莲类新药的研究提供有价值的先导化合物。

目前结构改造的方法主要有化学合成与生物转化。生物转化是一种利用微生物酶对活性成分进行结构修饰的重要方法，其本质是一种酶催化反应。较之化学合成的方法，生物转化具备反应条件温和、立体选择性强及空间选择性高等优点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种来自植物穿心莲的内生真菌及其对穿心莲内酯二萜类物质的转化应用。

本发明的第一方面是提供了一种镰刀菌(Fusarium sp.)LM19J01，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2015659。

在一优选例中，所述菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第二方面是提供了上述菌株在转化新穿心莲内酯中的应用。

本发明的第三方面是提供了一种转化新穿心莲内酯的方法，所述方法包括在上述菌株的发酵内生真菌培养液中加入新穿心莲内酯，发酵转化培养得到转化化合物。

在一优选例中，所述方法的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

在另一优选例中，所述方法的培养条件为26～30℃、100～150rpm振荡培养5～9天。

在另一优选例中，所述方法的培养条件为28℃、120rpm振荡培养7天。

在另一优选例中，所述新穿心莲内酯的浓度为0.05～0.15mg/ml。

在另一优选例中，所述的转化化合物为：

本发明还提供了一种可用上述方法制备获得的化合物，所述化合物具有如下结构式：

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1为穿心莲内生真菌菌株LM19J01对新穿心莲内酯的转化产物的HPLC图

其中，A为底物对照，B为菌液对照，C为转化实验组。

图2为转化化合物1的HMBC谱。

图3为转化化合物1的NOESY谱。

具体实施方式

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01，在分类学上属于镰刀菌属Fusarium，命名为Fusarium sp.LM19J01，已于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCC NO:M 2015659。该菌株的基因组18s rDNA碱基序列如SEQ ID No.1所示：

GACGATTGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCACTGGTGATTCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTTCCTTGTCCGAAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGC-GCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAACTACCACTCAGGGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAA(SEQ ID No.1)。

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01可采用内生真菌分离纯化技术从穿心莲(Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees)植物活体中分离、纯化得到。

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01可对新穿心莲内酯等进行生物转化，得到转化后的化合物。

如本发明所用，使用本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01对新穿心莲内酯进行生物转化的方法包括如下步骤：菌种的活化→转接入液体培养基→预培养→加入底物→控制条件，继续培养→终止转化，即得新化合物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1穿心莲内生真菌菌株LM19J01的分离、纯化与鉴定

取新鲜植物穿心莲根段，冲洗干净，浸于70％酒精中消毒4min，无菌水冲洗5次，置于1％次氯酸钠溶液中浸泡5min，再用无菌水冲洗5次，然后将根段种植于PDA培养基上，置28℃恒温箱培养2周后，取未出现真菌污染的外植体用1％次氯酸钠溶液灭菌15min，切割后接种于PDA培养基中培养。将样品边缘部分长出的菌丝，用接种针挑取接种于PDA培养基平板上，28℃恒温培养，长出新菌落后，再挑取其尖端菌丝转到PDA培养基平板上重复纯化5次以上，然后接到试管斜面上保存。

菌种鉴定：通过对菌落形态、子实体、孢子等的光镜及电镜观察，依据魏景超的《真菌鉴定手册》，对该穿心莲内生真菌LM19J01的形态描述及鉴定结果如下：

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01的固体培养特征为：

在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上于28±1℃培养，菌丝初始为乳白色，后变为浅粉色，丝状，菌落边缘不整齐，背面呈淡粉色。

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01的液体培养特征为：

a)培养基PDA，摇瓶培养7天，培养温度为28±1℃；

b)发酵培养特征：培养第1-2天，未见明显生长现象；培养第3天，有白色菌丝出现；培养第4-5天，菌丝增多；培养第6天，形成直径1-2mm白色菌丝球；培养第7天，菌丝球增大到2-4mm。

实施例2利用穿心莲内生真菌菌株LM19J01转化新穿心莲内酯

PDA固体培养基：其做法是先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加入15～20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，稍冷却后再补足水分至1000ml，pH自然。分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃，灭菌20分钟左右后取出摇匀，摆斜面或倒平板，冷却后贮存备用。

PDA液体培养基：其做法是先洗净去皮，再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20～30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，在滤液中加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000ml，pH自然。分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121℃，灭菌20分钟左右后取出摇匀，冷却后贮存备用。

一、培养菌株

1)取本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入100ml已灭菌的PDA固体培养基中，于28±1℃活化培养72小时；

2)取活化培养后的菌株，在无菌条件下，转接入100ml已灭菌的PDA液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养72小时，得种子液；

3)在无菌条件下，按10％(体积百分比)的接种量将种子液接入500mL PDA液体培养基中，于28±1℃、120rpm摇床培养2天，得到发酵内生真菌培养液。

二、用内生真菌转化新穿心莲内酯

1)将底物新穿心莲内酯加入至发酵内生真菌培养液中，底物浓度为0.1mg/ml，于28±1℃、120rpm摇床培养7天；

2)将培养得到的发酵转化培养液减压蒸馏回收，得到棕色膏状物。对该棕色膏状物进行高效液相色谱(HPLC)检测，得到5个化合物峰(图1)。具体检测条件和方法如下：

色谱柱：CAPCELL PAK C18(5μm 250mm×4.6mm)；流速：1ml/min；柱温：25℃；进样量：20ul；流动相：乙腈-水，等度洗脱；

检测波长：205nm(新穿心莲内酯)

Post time：5min

表1 HPLC洗脱方法

3)将上述棕色提取物减压干燥，结晶纯化共得到5个化合物。具体如下：

化合物A

白色无定型粉末；UV(MeOH)max(logε)206(4.18)nm；HR-ESI-MS：m/z 503.2630([M+Na]⁺,C₂₆H₄₀O₈Na⁺；calc.503.2621)，分子式为C₂₆H₄₀O₈；IR：3375cm^-1(羟基)，1742、1648cm^-1(α,β不饱和γ内酯)，904cm^-1(内酯环外亚甲基)；化合物A的¹H-NMR(见表2)和¹³C-NMR(见表3)，参照文献^[1]，化合物A被确定为新穿心莲内酯(neoandrographolide)，及残余的底物。

化合物1

白色无定型粉末；Legal及Kedde反应呈阳性，表明α,β不饱和γ内酯的存在；通过TLC分析，化合物1的极性大于底物；HR-ESI-MS：m/z 503.2630([M+Na]⁺，C₂₆H₄₀O₈Na⁺；calc.503.2621)，分子式为C₂₆H₄₀O₈；由化合物1的¹H-NMR(见表2)和¹³C-NMR(见表3)，可以看出葡萄糖和andrograpanin的存在，且化合物1的NMR数据与化合物A极其相似，初步推断：化合物1上所连接的为α-葡萄糖而不是化合物A上所连接的β-葡萄糖。α-葡萄糖基的存在可以从端基质子δ4.68(d,J＝3.7Hz,H-1′)及一系列的糖上的C谱数据，端基碳上H-1和H-2的耦合常数(JH1′,H2′＝3.7Hz)也说明了化合物1上的糖为α连接；在HMBC谱(图2)上，葡萄糖上的端基质子(δ_Η 4.68)与andrograpanin的C-19(δ_C 71.6)相关，这表明化合物1为 andrograpanin-19-O-α-D-glucopyranoside。此外，化合物1的α构型可以通过NOESY谱(图3)上的H-19、H-20的信号看出，正如化合物A的β构型可以通过NOESY谱(图3)上的H-9、H-18的信号看出。因此，化合物1的结构式如下，命名为isoneoandrographolide，为新化合物。

化合物2

白色无定型粉末；Legal及Kedde反应呈阳性，表明α,β不饱和γ内酯的存在；通过TLC分析，化合物2的极性大于底物；由化合物2的¹H-NMR(见表2)和¹³C-NMR(见表3)，参照文献^[2]，化合物2被确定为14-去氧穿心莲内酯(14-deoxyandrographolide)，结构式如下：

化合物3

白色粉末；Legal及Kedde反应呈阳性，表明α,β不饱和γ内酯的存在；通过TLC分析，化合物3的极性大于底物；由化合物3的¹H-NMR(见表2)和¹³C-NMR(见表3)，参照文献^[3]，化合物3被确定为8α,17β-环氧-3,14-二去氧穿心莲内酯(8α,17β-epoxy-3,14-dideoxyandrographolide)，结构式如下：

化合物4

白色无定型粉末；Legal及Kedde反应呈阳性，表明α,β不饱和γ内酯的存在；通过TLC分析，化合物4的极性小于底物；由化合物4的¹H-NMR(见表2)和¹³C-NMR(见表3)，参照文献^[4,5]，化合物4被确定为andrograpanin，结构式如下：

表2 新穿心莲内酯及其转化产物的H谱数据

表3新穿心莲内酯及其转化产物的C谱数据

参考文献：

[1]Al-Amin,M.,et al.,Neoandrographolide Isolated from Leaves of Adhatoda vasica Nees.Dhaka.Univ.J.Sci.,60(1),1-3(2012).

[2]Chen,L.X.,et al.,Microbial transformation of 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolide and14-deoxyandrographolide and inhibitory effects on nitric oxide production of the transformation products.Journal of J.Mol.Catal.B-Enzym.,72(3),248-255(2011).

[3]孟正木.穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物的结构研究.药学学报1981,16(8):571-574.

[4]Cangiano,T.,et al.,Lactone diterpenes from the aquatic plant Potamogeton natans.Phytochemistry,56(5),469-473(2001).

[5]Han,B.H.,et al.,In vitro platelet-activating factor receptor binding inhibitory activity of pinusolide derivatives:a structure-activity study.J.Med.Chem.,41(14),2626-2630(1998).

实施例3新穿心莲内酯及其转化产物的NO抑制活性研究

利用RAW264.7细胞对新穿心莲内酯及其转化产物的NO抑制活性进行研究：

RAW 264.7细胞在DMEN高糖培养基中(含青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL及10％的胎牛血清)培养。铺板密度为1×10⁴个/ml,CO₂培养箱中37℃孵育4小时后，设实验组(LPS+sample)、对照组(untreated)、LPS组(LPS)，加入相应溶液100μL(LPS浓度为3μg/mL)，继续孵育36h后，测定NO产生量。测定方法：按照NO检测试剂盒说明书进行。加入药物24h后，利用MTT法进行细胞毒活性的检测。NO含量通过0,1,2,5,10,20,50,and 100μM的NaNO₂释放NO的含量所做的工作曲线测得。

结果显示(见表4)：化合物A、化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的IC₅₀分别为21.5±0.7μM、35.6±0.9μM、34.7±1.4μM、52.1±1.4μM及24.5±1.2μM。

表4新穿心莲内酯及其转化产物的NO抑制活性结果(mean±SD,n＝3)

实验结果表明：新穿心莲内酯及其转化产物均具有抑制NO的活性。

生物材料的保藏

本发明的穿心莲内生真菌菌株LM19J01，在分类学上属于镰刀菌属Fusarium，命名Fusarium sp.LM19J01，已于2015年11月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏号为CCTCC NO:M 2015659。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。