一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用的制作方法

本发明涉及一种用于植物病害防控技术领域，具体涉及一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用。

背景技术：

葡萄在世界水果生产中占有重要的位置，我国鲜食葡萄年产量多年来一直位居世界各国首位，而葡萄灰霉病不仅是生产田中常见病害，更是产后贮藏过程中的毁灭性病害。因此，葡萄灰霉病已经是制约我国葡萄生产的一大障碍，更是保护地葡萄生产和葡萄贮藏期最为重要的病害种类之一，每年该病造成了巨大的经济损失。

葡萄灰霉菌，有性态为富氏葡萄孢盘菌[Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetzel.]，属子囊菌亚门葡萄孢盘菌属。无性态为灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea Pers.)，属半知菌亚门葡萄孢属。主要危害葡萄叶片，花穗和果实。叶片受害，初期即出现绿豆粒大的灰色斑点，扩大后成为淡褐色不规则斑片，潮湿时生有不规则灰霉层；花序发病后软腐并萎蔫，甚至整个花序坏死；果粒发病时出现褐色褪色斑点，病斑果皮易裂开，果皮易与果肉分离脱落。灰霉病菌腐生性强，寄主范围广，不同寄主植物间的灰霉病菌可相互引发灰霉病。

目前，对灰霉病菌的防治主要以化学防治为主，辅以生物防治和生态防治。化学防治往往导致病菌对杀菌剂产生抗药性，效果下降，使用浓度不断增多，导致环境和食品安全等诸多问题。灰葡萄孢菌因其具有高的基因漂移潜力和较大的种群尺度，容易产生抗药性。无公害、绿色农产品越来越受到人们的重视，而生物防治由于低污染、低残留的特性，成为目前研究的重点。研究表明一些真菌(如木霉菌和链霉菌)和细菌(如芽孢杆菌)对灰霉菌有一定的拮抗作用。

植物是筛选天然药物最主要的原料，内生真菌是指能够在健康植物组织内并与植物建立和谐关系的一类微生物，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，但不会对植物造成实质性的危害。植物内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了稳定的生态关系，一方面内生菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一方面内生菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要作用，可通过自身的代谢产物或借助于信号转导对植物体产生影响。内生菌具有种类繁多、易于定殖、发挥作用持久等特点，使得其在防治病害的过程中发挥了重大作用。有研究表明内生菌可以增强宿主植物的抗病性，是现代药物的重要来源之一。

目前已经有防治葡萄灰霉病的报道，如通过化学杀菌剂组合物防治葡萄灰霉病(中国专利，公开号CN201410543678.4，CN201310299766.X)，另外还有通过加强栽培管理技术减轻葡萄灰霉病的发生(中国专利，公开号CN201510374105.8，CN201310347735.7，CN201410493625.6，CN201410566149.6)；生物防治方面，主要利用蛇莓青色果实研磨液防治葡萄灰霉病(中国专利，公开号CN201410096937.3)。目前，尚未出现利用葡萄自身的内生真菌进行生物防治葡萄灰霉病的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用，该葡萄内生真菌对葡萄灰霉病防治效果好，具有重要的农业应用价值。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种葡萄内生真菌，其特征在于，该内生真菌命名为疣孢漆斑菌，其DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。

上述疣孢漆斑菌是从野生山葡萄品种‘双优’上分离得到。

经申请人的研究表明，上述葡萄内生真菌可以用于防治葡萄灰霉病的应用。

其具体的应用是将疣孢漆斑菌制成生物防治菌剂喷施在葡萄品种上，防治效果明显。

所述葡萄品种为欧洲葡萄‘红地球’品种。

所述生物防治菌剂通过以下两种方法制备：

(1)将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养15天，待菌落表面产生不规则黑色斑点，用无菌手术刀轻轻刮取疣状突起，溶于无菌水中，利用血球计数板计算孢子量，调整至1×10⁶个/mL，得到生物防治菌剂；

(2)将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养5天，用直径4mm的打孔器在菌落边缘打孔，每150mL查氏液体培养基接种8个菌饼，25℃下黑暗振荡培养15d，查氏液体培养基的培养液经4层纱布过滤，12000rpm离心10min，然后0.22μm过滤灭菌，得到生物防治菌剂。

所述的查氏液体培养基配方为：蔗糖：30g，KNO₃：2g，K₂HPO₄：1g，0.5g MgSO₄·7H₂O：0.5g，KCl：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，加蒸馏水定容至1000mL。

本发明的内生真菌通过形态鉴定和分子鉴定，确定为疣孢漆斑菌，属于半知菌类，漆斑菌属。通过对峙培养和分泌物抑制实验，发现该疣孢漆斑菌对葡萄灰霉菌具有较强的抑制作用。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

(1)该生物防治菌株疣孢漆斑菌是葡萄自身携带的内生真菌，可完全克服使用化学农药防治所带来的诸多问题，有利于葡萄无公害、绿色生产、有利于提高葡萄果实的商品性、有利于节省成本，具有潜在的应用前景。

(2)对峙培养和抑菌实验都显示该生物防治菌株对葡萄灰霉菌的生长发育有较好的抑制作用，活体实验也显示菌剂喷施在葡萄品种后，防治效果明显，而且具有安全、无环境污染等优点，可应用于葡萄灰霉病的防治。

附图说明

图1是疣孢漆斑菌的菌落形态特征图片。其中，A图是在PDA培养皿上生长15天的菌落正面形态；B图是在PDA培养皿上生长15天的菌落反面形态；C图是在PDA培养皿上生长15天的菌丝形态，标尺为500μm；D图和E图是菌落表面的漆状黑色斑点的形态，D图标尺为1mm，E图标尺为200μm；F是疣孢漆斑菌的孢子形态，标尺为10μm。

图2是疣孢漆斑菌菌剂制备图。其中，A图是孢子悬浮液；B图是疣孢漆斑菌液体培养15天的情况；C图是疣孢漆斑菌发酵液。

图3是疣孢漆斑菌拮抗葡萄灰霉菌的生长图。其中，A图是葡萄灰霉菌在正常的PDA培养皿上生长4天的形态；B图是在有疣孢漆斑菌的PDA上葡萄灰霉菌生长4天的对峙情况；C图是对峙培养1个月的情况。

图4是疣孢漆斑菌分泌物对葡萄灰霉菌生长的抑制情况图片。其中，A图是葡萄灰霉菌在PDA上生长4天的情况；B图是葡萄灰霉菌在含有疣孢漆斑菌分泌物的PDA上培养4天的情况。

图5是疣孢漆斑菌在葡萄叶片上的防治图片。图中，MV代表疣孢漆斑菌。

图6是疣孢漆斑菌在葡萄果实上的防治图片，为接种8天后的发病状态，标尺为2cm。

以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1：内生真菌疣孢漆斑菌的分离和鉴定

经发明人研究发现，中国野生山葡萄品种‘双优’对葡萄灰霉病具有较强的抗性，因此，取田间中国野生山葡萄品种‘双优’葡萄叶片，用无菌水漂洗3次，浓度为70％的酒精表面消毒30s，浓度为2.5％的次氯酸钠消毒3min后，再用无菌水漂洗3次。叶片剪取3mm×5mm大小的组织，放置在PDA平板上25℃条件下进行培养。待叶片组织周围长出内生菌丝后，挑取菌落边缘菌丝转移至新的PDA培养基上，产孢后通过单孢分离纯化内生真菌。

提取该内生真菌株的DNA，通过ITS引物扩增(正向引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’，反向引物：5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’)，产物片段大小为544bp，测序该产物片段的DNA序列如下：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA(核苷酸或氨基酸序列表，SEQ ID NO.1)。

将序列在NCBI数据库中进行比对，结果与疣孢漆斑菌的序列一致性最高，因此命名为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)。

形态观察发现该疣孢漆斑菌，25℃下，在PDA培养基上生长15天后，气生菌丝为白色，疣孢漆斑菌菌落圆形扁平，边缘整齐，气生菌丝为白色，菌落表面产生不规则的疣状突起，突起内部有分生孢子。分生孢子宽梭状(见图1)。

实施例2：疣孢漆斑菌生物防治菌剂的制备

1、将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养15天，待培养的菌落表面产生不规则黑色斑点，用无菌手术刀轻轻刮取漆状黑色斑点，溶于无菌水中，利用血球计数板计算孢子量，调整至1×10⁶个/mL，得到生物防治菌剂备用(图2A)。

2、将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养5天，用直径4mm的打孔器在菌落边缘打孔，每150mL查氏液体培养基接种8个菌饼，25℃下黑暗振荡(100rpm)培养15d(图2B)。查氏液体培养基的培养液经4层纱布过滤，12000rpm离心10min，然后0.22μm过滤灭菌，得到生物防治菌剂备用。

查氏液体培养基配方：蔗糖：30g，KNO₃：2g，K₂HPO₄：1g，MgSO₄·7H₂O：0.5g，0.5g KCl：0.5g，FeSO₄·7H₂O：0.01g，加蒸馏水定容至1000mL。

实施例3：疣孢漆斑菌对葡萄灰霉菌的拮抗活性测定

由于疣孢漆斑菌生长较慢，提前将疣孢漆斑菌接种于PDA培养基上，距离中心2-3cm左右，25℃下生长5天后，菌落直接达到2cm时，将葡萄灰霉菌接种于PDA培养皿的另一侧，以不接种疣孢漆斑菌的PDA为对照，接种后4天拍照并计算菌落面积，连续观察1个月。结果发现疣孢漆斑菌对葡萄灰霉菌的生长具有较强的抑制作用，培养4天后的葡萄灰霉菌菌落面积显著低于对照，而且培养1个月后发现疣孢漆斑菌能产生一个明显的抑菌圈(图3)。

为了进一步确认疣孢漆斑菌分泌到培养基中的活性物质是否对灰霉菌的生长发育有抑制作用。首先，将疣孢漆斑菌接种于铺有玻璃纸的PDA培养基上生长10天，然后去掉玻璃纸，把PDA培养基倒置，然后分别接种葡萄灰霉菌，接种后观察菌落生长情况并统计菌落直径，以无菌PDA为对照。结果发现在培养过疣孢漆斑菌的培养基上，葡萄灰霉菌无法生长(图4)。

以上结果说明疣孢漆斑菌对葡萄灰霉菌的生长发育具有明显的抑制拮抗作用。

实施例4：疣孢漆斑菌防治葡萄灰霉病的活体实验

叶片防治实验：采用接种葡萄灰霉菌菌饼和孢子2种方法进行，疣孢漆斑菌培养液和孢子作为2种处理。取田间欧洲葡萄‘红地球’品种一年生新梢顶端往下2-3节幼叶带回实验室，无菌水漂洗3次，用浓度70％的酒精消毒30秒，再用无菌水漂洗3次，用吸水纸擦干叶片表面水，分别用疣孢漆斑菌培养液和孢子(1×10⁶个孢子/mL)进行处理，一方面用疣孢漆斑菌培养液处理12小时后分别接种葡萄灰霉菌菌饼和孢子(1×10⁶个孢子/mL)；另一方面用疣孢漆斑菌孢子接种3天后再分别接种葡萄灰霉菌菌饼和孢子，接种后的叶片放置在铺有湿润滤纸的方形铁盘中，用保鲜膜覆盖，保持湿度，然后将接种盘放置在25℃光照培养箱中，16小时光照/8小时黑暗。接种葡萄灰霉菌3天后观察发病情况并拍照，统计病斑面积，以未处理直接接种葡萄灰霉病菌菌饼和孢子为对照。结果发现疣孢漆斑菌的孢子和培养液处理欧洲葡萄‘红地球’品种的叶片可明显防治葡萄灰霉病的发生(图5)。

果实防治实验：样品前期处理和培养方法同上，疣孢漆斑菌孢子(1×10⁶个孢子/mL)接种红地球果实3天后，接种葡萄灰霉病菌孢子(1×10⁶个孢子/mL)10天后观察发病情况，以只接种葡萄灰霉病菌孢子的果实为对照。结果发现用疣孢漆斑菌的孢子处理欧洲葡萄‘红地球’品种的果实同样具有较好的防治效果(图6)。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用

<160>

<210>1

<211>544

<212>SEQ ID NO.1

<213>DNA

<220>

<400>1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210>2

<211>25

<212>正向引物

<213>

<220>

<400>2

5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3

<210>3

<211>25

<212>反向引物

<213>

<220>

<400>2

5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学大学

<120>一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用

<160>

<210> 1

<211> 544

<212> SEQ ID NO. 1

<213> DNA

<220>

<400> 1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210> 2

<211> 25

<212>正向引物

<213>

<220>

<400> 2

5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3

<210> 3

<211> 25

<212>反向引物

<213>

<220>

<400> 2

5’- TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’