用于鉴定牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用的制作方法

本发明涉及一种用于鉴定牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用。

背景技术：

牛支原体(Mycoplasma bovis，MB)主要引起牛呼吸困难、气喘、咳嗽，同时还可引起关节炎、乳房炎、生殖道炎、角膜结膜炎、耳炎等。谢建华等人在2008-2013年间对重庆地区1606份牛血清样品进行检测，结果显示MB阳性率为49.00％。郭澍强等人对宁夏16个规模化养殖场的460份牛血清进行了牛支原体抗体的检测,结果显示MB阳性率为32.17％。

牛传染性鼻气管炎病毒(bovine herpesvirusⅠ，IBRV)又称为传染性牛鼻气管炎病毒，主要引起牛高热、鼻炎、呼吸困难和母畜流产等疾病。该病影响牛群的繁殖和产奶，给养牛业造成了巨大的经济损失，我国将其列为二类动物疫病。韩照清等人在2011年间采自西藏(988份)、青海(475份)和四川(377份)共1840份牦牛血清样品进行牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测，结果IBRV阳性率分别为38.6％、44.6％、27.9％。孙庆宇等人(2014年)在内蒙古地区16个奶牛养殖场的2321头奶牛进行牛传染性鼻气炎血清流行病学调查，结果显示IBRV平均阳性率为75.7％。张弦等人(2015年)对上海地区19个规模化牧场共920份血清样品进行IBRV血清抗体检测,结果表明IBRV抗体阳性率为46.74％。李永琴等(2016年)对宁夏地区18个规模化奶牛场470份血清进行牛传染性鼻气管炎的血清学调查，结果显示平均阳性率达到71.9％。

牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒均能引起牛呼吸道疾病，临床症状态相似难以区分，因此急需建立牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测技术，为牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的防控提供技术支持。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于鉴定牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用。

本发明首先保护一种引物组合，为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物对甲和引物对乙组成；

(a2)所述引物对甲；

(a3)所述引物对乙；

所述引物对甲由引物F1和引物R1组成；

所述引物F1为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1为如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物对乙由引物F2和引物R2组成；

所述引物F2为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2为如下(c3)或(c4)：

(c3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(c4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒；

(d2)鉴定待测病原微生物是否为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒；

(d3)鉴定待测样本是否感染了牛支原体和/或牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒；

(d2)鉴定待测病原微生物是否为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒；

(d3)鉴定待测样本是否感染了牛支原体和/或牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)鉴别牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒；

(d2)鉴定待测病原微生物是否为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒；

(d3)鉴定待测样本是否感染了牛支原体和/或牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种鉴别待测病原微生物为牛支原体还是牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病原微生物的核酸；

(2)以步骤(1)得到的核酸为模板，采用所述引物对甲和所述引物对乙进行二重二温式PCR，然后进行如下判断：如果得到大小为412bp的扩增产物，待测病原微生物为牛支原体；如果得到大小为727bp的扩增产物，待测病原微生物为牛传染性鼻气管炎病毒。

所述待测病原微生物为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴定待测病原微生物是否为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病原微生物的核酸；

(2)以步骤(1)得到的核酸为模板，采用所述引物对甲和所述引物对乙进行二重二温式PCR，然后进行如下判断：如果得到大小为412bp的扩增产物，待测病原微生物为或候选为牛支原体；如果得到大小为727bp的扩增产物，待测病原微生物为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染牛支原体和/或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样本的核酸；

(2)以步骤(1)得到的核酸为模板，采用所述引物对甲和所述引物对乙进行二重二温式PCR，然后进行如下判断：如果得到大小为412bp的扩增产物，待测样本感染或疑似感染牛支原体；如果得到大小为727bp的扩增产物，待测样本感染或疑似感染牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴别待测病原微生物为牛支原体还是牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特异DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特异DNA分子，如果待测病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特异DNA分子、待测病原微生物为牛支原体，如果待测病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特异DNA分子、待测病原微生物为牛传染性鼻气管炎病毒。所述待测病原微生物为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴定待测病原微生物是否为牛支原体或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：检测待测病原微生物的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特异DNA分子或是否具有序列表的序列6所示的特异DNA分子，如果待测病原微生物的核酸中具有序列表的序列5所示的特异DNA分子、待测病原微生物为或候选为牛支原体，如果待测病原微生物的核酸中具有序列表的序列6所示的特异DNA分子、待测病原微生物为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染牛支原体和/或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤：检测待测样本的核酸中是否具有序列表的序列5所示的特异DNA分子和/或是否具有序列表的序列6所示的特异DNA分子，如果待测样本的核酸中具有序列表的序列5所示的特异DNA分子、待测样本感染或疑似感染牛支原体，如果待测样本的核酸中具有序列表的序列6所示的特异DNA分子、待测样本感染或疑似感染牛传染性鼻气管炎病毒。

以上任一所述待测病原微生物为牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、蓝舌病病毒、牛轮状病毒或小反刍兽疫病毒。所述牛病毒性腹泻病毒为牛病毒性腹泻病毒Oregon株、牛病毒性腹泻病毒NADL株或牛病毒性腹泻病毒牦牛株。所述口蹄疫病毒为口蹄疫病毒A型、口蹄疫病毒O型或口蹄疫病毒AsiaⅠ型。所述水泡性口炎病毒为水泡性口炎病毒NJ型或水泡性口炎病毒IND型。所述蓝舌病病毒为蓝舌病病毒血清4型、蓝舌病病毒血清8型、蓝舌病病毒血清9型、蓝舌病病毒血清15型、蓝舌病病毒血清17型或蓝舌病病毒血清18型。所述牛轮状病毒为牛轮状病毒NCDV株或牛轮状病毒014株。所述小反刍兽疫病毒为小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株。

以上任一所述牛支原体为牛支原体GL-1株或牛支原体BS-1株。以上任一所述牛传染性鼻气管炎病毒为传染性牛鼻气管炎病毒Nu/67株。

以上任一所述待测样本为离体的动物组织，例如牛肉、牛肉加工制成的食品、牛内脏，牛内脏加工制成的食品等等。

以上任一所述核酸为DNA和RNA的混合物。

以上任一所述提取待测样本的核酸为使用RNA/DNA共提试剂盒提取得到的核酸。

以上任一所述核酸为基因组DNA。

以上任一所述提取待测样本的核酸为进行基因组DNA提取得到的核酸。

以上任一所述二重二温式PCR的退火延伸温度为55℃～68℃，优选为67℃。以上任一所述二重二温式PCR的最优反应程序为：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35个循环；72℃10min。。

以上任一所述二重二温式PCR的初始反应体系为(25μL)：MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每条引物1～10pmol/μL。以上任一所述二重二温式PCR的最优初始反应体系为(25μL)：MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量为水。

多重PCR是一种高效的PCR，可在同一个PCR反应管内，同时鉴别检测多种病原体，在多种病原混合感染的鉴别诊断上具有很高的优势和临床实用价值。二温式PCR是在常规PCR基础上发展而成的更简便的PCR检测技术，二温式PCR将退火和延伸在同一温度下完成，退化温度比常规三温式PCR的高，因此不仅提高了PCR的特异性，且二温式PCR省略了反复升温降温的时间消耗，节省时间，提高疾病的诊断效率。本发明提供的方法，全程只需一次抽提、一次PCR、一次电泳即可检测两种病原，非常适合混合感染的样品，省时省力。

近几年养牛饲业规模的不断扩大，疫病防治工作正面临着前所未有的压力，需要简便、快速、高通量检测技术以保证养牛业的健康发展。本发明提供了用于鉴定牛支原体(MB)的引物对甲和用于鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的引物对乙，并基于两个引物对开发了二重二温式PCR方法。采用引物对甲和引物对乙，通过二重二温式PCR检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒，具有特异性好、灵敏度高、普适性好、方便快速等优点，可用于临床鉴别诊断和流行病学调查。本发明为牛病的防控提供了新的技术方法，具有很高的临床应用价值。

附图说明

图1为实施例4的结果。

图2为实施例5的结果。

图3为实施例6的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。RNA/DNA共提试剂盒：大连宝生物公司。pEASY-T1载体：大连宝生物公司。实施例中用到的各个毒株见表1。

表1

实施例1、引物的设计

对牛支原体的基因组DNA以及牛传染性鼻气管炎病毒的基因组DNA进行序列分析，在序列分析的基础上选择靶点并设计引物，得到由数千个引物对组成的引物对库。对引物对库中的各个引物对一一进行预实验，检测引物对的灵敏度、特异性和普适性，最终得到用于鉴定牛支原体的的引物对甲和用于鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物对乙。

引物对甲由如下引物F1和引物R1组成(5’→3’)：

F1(序列表的序列1)：GCAACATGAAACCTTATACGA；

R1(序列表的序列2)：ATCCTCATAGAATTGTTCAAAGA。

引物对乙由如下引物F2和引物R2组成(5’→3’)：

F2(序列表的序列3)：CGGCGTCATTTACAAGGAGAA；

R2(序列表的序列4)：GGCCGTGAAGCGGAAGTT。

引物对甲的靶序列为412bp。引物对乙的靶序列为727bp。

实施例2、参数优化

引物对甲和引物对乙进行二重二温式PCR的参数优化。被优化的参数包括反应体系的参数和反应程序的参数。反应体系的参数包括(25μL)：初始反应体系中，MgCl₂的浓度、Taq DNA Polymerase的含量、dNTP的浓度、各条引物的浓度。反应程序的参数包括：退火延伸温度。

建议初始反应体系为(25μL)：MgCl₂ 1～10mmol/L、Taq DNA Polymerase 1～5U、dNTP 0.1～0.8mmol/L、每条引物1～10pmol/μL。最优初始反应体系为(25μL)：MgCl₂1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量为水。

建议退火延伸温度为55℃～68℃。最优退火延伸温度为67℃。最优反应程序为：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35个循环；72℃10min。

实施例3、方法的建立

1、采用RNA/DNA共提试剂盒提取待测样本的核酸。

2、取步骤1得到的核酸，作为模板，进行二重二温式PCR。

初始反应体系为(25μL)：MgCl₂ 1.5mmol/L、Taq DNA Polymerase 2.5U、dNTP 0.2mmol/L、引物F1 1pmol/μL、引物R1 1pmol/μL、引物F2 1pmol/μL、引物R2 1pmol/μL、10×buffer 2.5μL、模板1μL，余量为水。

反应程序为：42℃30min；94℃5min；94℃30s、67℃30s，35个循环；72℃10min。

3、取步骤2的产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳。

实施例4、特异性实验

待测样本为：表1中的所有DNA病毒、表1中的所有RNA病毒的cDNA(将每个RNA病毒提取总RNA并反转录得到cDNA)，以及牛支原体BS-1株和传染性牛鼻气管炎病毒Nu/67株的混合物。

按照实施例3建立的方法进行检测。

设置用牛肉作为待测样本的阴性对照。

部分结果见图1。图1中，M对应DNA marker(100bp ladder)，1对应传染性牛鼻气管炎病毒Nu/67株，2对应牛支原体BS-1株，3对应混合物，4对应口蹄疫病毒A型，5对应水泡性口炎病毒NJ型，6对应蓝舌病病毒血清4型，7对应牛病毒性腹泻病毒Oregon株，8对应牛轮状病毒NCDV株，9对应小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株，10对应阴性对照。

牛支原体GL-1株、牛支原体BS-1株均在300bp-500bp之间显示特异性条带，经测序均为412bp。传染性牛鼻气管炎病毒Nu/67株在700bp-800bp之间显示特异性条带，经测序均为727bp。混合物显示两条特异条带，经测序，一条为412bp，另一条为727bp。其他各个毒株均不显示任何条带。

结果表明，采用引物对甲和引物对乙通过二重二温式PCR检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒具有如下优点：对其它病毒不存在非特异性扩增，对宿主动物(牛)不存在非特异性扩增，特异性优良；对牛支原体具有良好的普适性，各个毒株得到412bp的扩增产物；可以实现对牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒混合样本的检测，并同时读出结果。

实施例5、敏感性实验

将序列表的序列5所示的双链DNA分子，克隆入pEASY-T1载体，得到标准品质粒甲。

将序列表的序列6所示的双链DNA分子，克隆入pEASY-T1载体，得到标准品质粒乙。

以标准品质粒甲和标准品质粒乙为溶质，以双蒸水为溶剂，得到各个标准品溶液。标准品溶液1中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10⁸拷贝/μL。标准品溶液2中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10⁷拷贝/μL。标准品溶液3中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10⁶拷贝/μL。标准品溶液4中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10⁵拷贝/μL。标准品溶液5中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10⁴拷贝/μL。标准品溶液6中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10³拷贝/μL。标准品溶液7中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1×10²拷贝/μL。标准品溶液8中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为10拷贝/μL。标准品溶液9中，标准品质粒甲和标准品质粒乙的浓度均为1拷贝/μL。

以标准品溶液为模板，按照实施例3建立的方法(步骤2和步骤3)进行检测。

结果见图2。图2中，M对应DNA marker(100bp ladder)，1至9依次对应标准品溶液1至标准品溶液9。

结果表明，采用引物对甲和引物对乙通过二重二温式PCR检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒具有如下优点：对牛支原体的的最低检测限为10000个拷贝，对牛传染性鼻气管炎病毒的最低检测限为10000个拷贝。

实施例6、干扰性实验

以实施例5制备的标准品质粒甲和标准品质粒乙为溶质，以双蒸水为溶剂，得到各个样品溶液。样品溶液A中，标准品质粒甲的浓度为10⁴拷贝/μL，标准品质粒乙的浓度为10⁸拷贝/μL。样品溶液B中，标准品质粒甲的浓度为10⁵拷贝/μL，标准品质粒乙的浓度为10⁷拷贝/μL。样品溶液C中，标准品质粒甲的浓度为10⁶拷贝/μL，标准品质粒乙的浓度为10⁶拷贝/μL。样品溶液D中，标准品质粒甲的浓度为10⁷拷贝/μL，标准品质粒乙的浓度为10⁵拷贝/μL。样品溶液E中，标准品质粒甲的浓度为10⁸拷贝/μL，标准品质粒乙的浓度为10⁴拷贝/μL。

以样品溶液为模板，按照实施例3建立的方法(步骤2和步骤3)进行检测。

结果见图3。图3中，M对应DNA marker(100bp ladder)，1至5依次对应样品溶液A至样品溶液E。

结果表明，采用引物对甲和引物对乙通过二重二温式PCR检测牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒有如下优点：当一个引物对的靶标物浓度较高，而另一个模板的靶标物较低时，依然可以同时检测到两种靶标物，不影响扩增效率，相互不受干扰。

SEQUENCE LISTING

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 用于鉴定牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用

<130> GNCYX170639

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaacatgaa accttatacg a 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcctcatag aattgttcaa aga 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggcgtcatt tacaaggaga a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggccgtgaag cggaagtt 18

<210> 5

<211> 412

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcaacatgaa accttatacg aaaatggctt gttaataaaa aacaaagact ataacttttg 60

gattaatcag tttaataaaa ttaaagaaat tttaagtttc aaaaacaata attatattaa 120

tgaactaact aacaaaatgc atcaagcagc caataatatg caatttgaac ttgcattatt 180

tttgcgtgat ggcttaacat atttaaaaaa gttaaaagaa agtcaaatta tagagctaag 240

tcaatataaa aatattgacg tatttgctta taaaacagac gaaaaattaa tttttgctac 300

agttttgttc tatcgctatg gaatattaat caacaaggtt aatttaacaa ttccactagg 360

tttaagtgtt gatgaatcac ttagagtttt ctttgaacaa ttctatgagg at 412

<210> 6

<211> 727

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggcgtcatt tacaaggaga acatcgcgcc gtacacgttc aaggcctaca tttactacaa 60

aaacgtgctc gtgaccggga aaagcccggg gggcacgtac gcggccatta caaaccagta 120

cacggaccgc atgcccgtgg gcatgggcga gatcacggac ctggtggaca agaagtggca 180

ctgcctttcg aaagccgagt acctgcgcag cgggcgcaag gtggtggcct ttgaccgcga 240

cgacgacccc tgggaggcgc cgctgaagcc tgcgcggctg agcgcgcccg gggtgcgggg 300

ctggcacacg acggacgatg tgtacacggc gctgggctcg gcggggctct accgcacggg 360

cacctctgtg aactgcatcg tggaagaagt ggaggcgcgc tcggtgtacc cgtacgactc 420

gttcgcgctc tcgaccgggg acattatcta catgtcgccc ttttacgggc tgcgcgaggg 480

cgcgcaccgc gagcacacca gctactcgcc ggagcgcttc cagcagatcg agggctacta 540

caagcgcgac atggccacgg gccggcgcct caaggagccg gtctcgcgga actttttgcg 600

tacacagcac gtgacggtag cctgggactg ggtgcccaag cgcaaaaacg tgtgctcgct 660

ggccaagtgg cgcgaggcgg acgaaatgct gcgagacgag agccgcggga acttccgctt 720

cacggcc 727