本发明涉及一种马立克氏病毒的悬浮培养方法，属于兽用生物制品
技术领域：
。
背景技术：
：马立克氏病(marek’sdisease，md)是由疱疹病毒科、细胞结合性马立克氏病病毒(marek’sdiseasevirus，mdv)引起的一种高度接触传染性、淋巴组织增生性肿瘤疾病。1907年，匈牙利病理学家josephmarek首先报道此病。1970年随着疫苗的使用，该病首次得以控制。直到目前，疫苗接种仍是预防md最有效的方式之一，而使用疫苗近50年来，传统疫苗的生产方式一直都是以原代鸡胚成纤维细胞作为制苗材料，采用转瓶的方式培养。但是传统的马立克氏病毒培养方法存在诸多缺陷：原代细胞制备费时费力、操作程序繁琐、易污染外源病毒、十分依赖spf种胚的供应、且疫苗产量及质量不稳定。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种马立克氏病毒的悬浮培养方法，该方法用微载体结合悬浮的方式对马立克氏病毒进行培养，操作简便，稳定性强的特点，同时克服了传统疫苗生产受制于鸡胚的供应的缺点，避免了感染外源病毒的风险。实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种马立克氏病毒的悬浮培养方法，包括以下步骤：1)鸡胚源df-1细胞系的传代与培养：以鸡胚源df-1细胞系作为制备病毒用细胞；将鸡胚源df-1细胞经胰酶-edta细胞分散液消化成单个均匀细胞，然后置于细胞生长液继续培养，当细胞长成单层时，用于继续传代或接种病毒；2)细胞毒种的繁殖：用稀释液将马立克氏病毒种稀释，将病毒和经步骤1)处理的df-1细胞一起接入含细胞培养液的培养瓶中进行培养，当细胞病变时收获细胞毒作为毒种；3)制苗用病毒的吸附培养：将从步骤2)得到的毒种稀释为病毒液，将病毒和新的鸡胚源df-1细胞一起接入含有微载体和悬浮培养液的培养瓶中，进行悬浮吸附培养；4)病毒的增殖培养及收获：弃去悬浮培养液，加入病毒增殖培养液进行悬浮增殖培养；当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。作为优选，马立克氏病毒为马立克氏病血清ⅰ型cvi988/rispens株、814株、血清ⅱ型sb-1株、血清ⅲ型火鸡疱疹病毒fc-126株中的至少一种。作为优选，步骤2)中，接种病毒的感染复数为0.001-1。作为优选，步骤3)中，悬浮培养液为含体积百分比5-10％新生牛血清的dmem/f12培养基。作为优选，步骤3)中，培养瓶中的微载体和细胞的个数之比为1:50～250。作为优选，步骤3)中，微载体的浓度为1-5g/l。作为优选，步骤3)中，悬浮吸附培养的时间为12-48h；培养温度为36～38℃。作为优选，步骤4)中，病毒增殖培养液为含体积百分比2％新生牛血清的dmem/f12培养基。作为优选，步骤4)中，悬浮增殖培养的时间为24-72h；培养温度为36～38℃。作为优选，步骤3)和步骤4)中，在培养的过程中对培养液进行搅拌；搅拌的方式为间歇搅拌或连续搅拌；搅拌速度为20-50rpm。相比现有技术，本发明的有益效果在于：与现有技术相比，本发明结合了马立克氏病毒和df-1细胞的生物学特性，利用微载体悬浮培养马立克氏病毒，培养密度高，不影响细胞质量；不仅能够解决传统马立克氏病毒培养依赖spf种胚的供应、原代细胞制备费时费力、操作程序繁琐、易污染外源病毒的问题，同时也能对病毒培养实时监控，节省人力，生产用地少，成本低，并且与商品疫苗相比，用此方法培养的马立克氏病毒疫苗对马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有同等效力的免疫保护作用。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：一种马立克氏病毒的悬浮培养方法，包括以下步骤：1)鸡胚源df-1细胞系的传代与培养：以鸡胚源df-1细胞系作为制备病毒用细胞；将鸡胚源df-1细胞经胰酶-edta细胞分散液消化成单个均匀细胞，然后置于细胞生长液继续培养，当细胞长成单层时，用于继续传代或接种病毒；2)细胞毒种的繁殖：用稀释液将马立克氏病毒种稀释，以感染复数为0.001-1将病毒和经步骤1)处理的df-1细胞一起接入含细胞培养液的培养瓶中进行培养，当细胞病变时收获细胞毒作为毒种；在此感染复数范围内，既能保证病毒复制的滴度，同时不至于因为病毒接种量太高而导致细胞发生病变的时间提前，造成细胞过快的产生病变导致细胞凋亡；3)制苗用病毒的吸附培养：将从步骤2)得到的毒种稀释为病毒液，将病毒和新的鸡胚源df-1细胞一起接入含有微载体和悬浮培养液的培养瓶中，进行悬浮吸附培养；微载体优选采用cytodex系列微载体；该系列微载体相比现有的其他微载体，能够提供更大的细胞培养面积，保证细胞的密度及病毒收获的蚀斑数，从而节约成本，提高病毒滴度；cytodex系列微载体以交联葡聚糖作为基质，具有细胞贴壁快，生长快等特点，同时能提供较大的细胞贴壁面积；尤其是cytodex1微载体，每克干重能够提供4400cm2的细胞贴壁面积，相对于以聚酯材料和聚苯乙烯为基质的纸片载体(每克干重提供1600cm2细胞贴壁面积)及bionoc-ii聚酯纤维载体(每克干重提供2400cm2细胞贴壁面积)具有明显的优势。同时，cytodex系列微载体因体积小，在搅拌式培养瓶中能够充分悬浮于培养液中，使细胞充分和培养液接触，最大程度地提高了培养液的利用率，而且方便随时取样进行观察，以便于对培养过程进行实时监控，掌握培养进程。4)病毒的增殖培养及收获：弃去悬浮培养液，加入病毒增殖培养液进行悬浮增殖培养；当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。其中，马立克氏病毒为马立克氏病血清ⅰ型cvi988/rispens株、814株、血清ⅱ型sb-1株、血清ⅲ型火鸡疱疹病毒fc-126株中的至少一种。其中，步骤3)中，悬浮培养液为含体积百分比5-10％新生牛血清的dmem/f12培养基；培养瓶中的微载体和细胞的个数之比为1:50～250，微载体的浓度为1-5g/l；悬浮吸附培养的时间为12-48h；培养温度为36～38℃；在悬浮吸附培养的时间中，细胞能够充分吸附于微载体，并且避免了培养时间过长而使得新生牛血清对细胞的增殖产生影响；微载体和细胞的个数之比1:50～250能够保证细胞能在微载体表面形成致密的细胞单层，从而有利于马立克氏病毒的复制；微载体的浓度为1-5g/l是本发明中马立克氏病毒培养的最佳条件，微载体浓度过高会增加细胞间的剪切力，造成细胞损伤，不利于病毒培养。其中，步骤4)中，步骤4)中，病毒增殖培养液为含体积百分比2％新生牛血清的dmem/f12培养基；悬浮增殖培养的时间为24-72h；培养温度为36～38℃；病毒增殖培养时间的控制能够提高病毒的滴度。其中，步骤3)和4)中所用的培养瓶采用瑞士integra公司生产的spinnerflask，瓶中设有带有两个磁力搅拌桨，并且对磁力搅拌桨的大小，形状及高度进行了优化，独特的设计可按要求提供平稳、均匀的转动，可提高氧气供应及最小化的剪切力以确保理想的细胞生长条件。通过搅拌桨来搅动培养液，以增加质传效果，确保培养液的养分和溶氧浓度的均匀分布，到达细胞良好培养的目的；优选的方式为设定搅拌速度20-50rpm，在此速度下，能保证细胞在最低剪切力下充分均匀的悬浮；剪切力太大，容易造成细胞损伤，不利于病毒增殖；转速太低则细胞容易沉底，无法充分均匀悬浮，导致培养液利用率下降，同时会造成细胞聚集，不利于病毒复制。实施例1-2：不使用微载体的悬浮培养过程实施例1：常规接毒组1)鸡胚源df-1细胞系的传代与培养：以鸡胚源df-1细胞系作为制备病毒用细胞；将鸡胚源df-1细胞经0.25％胰酶-edta细胞分散液消化成单个均匀细胞，以1:3-6的比例进行传代，然后置于含体积百分数10％新生牛血清的dmem/f12细胞生长液中继续培养，培养温度为37℃；当细胞长成单层时，用于继续传代或接种病毒；2)马立克氏病毒的繁殖：用稀释液将cvi988/rispens病毒种稀释，接种至步骤1)中长至单层的df-1细胞上，接种量为7×104pfu/t25细胞培养瓶；加入含体积百分数2％新生牛血清的dmem/f12细胞维持液后，在温度为37℃的条件下培养，每天观察细胞病变；3)病毒的收获：当接入的细胞病变率达80％以上时，弃去细胞维持液，加入0.25％胰酶-edta消化液，使其与细胞充分接触后弃去，然后加入血清终止消化，并用培养基吹打使细胞分散均匀，经800rpm离心10min，收集沉淀细胞，得到病毒；4)保存：将病毒分别用细胞培养液重悬，加入等体积冻存液分装冻存管，置于程序降温盒中，达到-70℃后，放入液氮中保存。实施例2：同步接毒组实施例2的特点在于，步骤2)马立克氏病毒的繁殖：将步骤1)中的df-1单层细胞消化成单个均匀细胞，并且同时和稀释后的cvi988/rispens病毒接种至t25细胞培养瓶中，接种量为7×104pfu/培养瓶；用含体积百分比10％新生牛血清的dmem/f12培养基培养24h后，换成含体积百分比2％新生牛血清的dmem/f12培养基继续培养，其余步骤和参数与实施例1相同。对实施例1和2进行检测：1、病毒蚀斑检测：按常规方法制备次代的鸡胚成纤维细胞，接种于96孔板继续培养24h备用。将冻存于液氮中的病毒进行复苏，37℃水浴速融后倍比稀释接种至96孔板，每孔0.1ml，设置8个平行重复。观察细胞病变率，计算出病毒蚀斑数。2、抽样检验：按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2015年版)中“鸡马立克氏病活疫苗(cvi988/rispens株)”的检验标准进行检验。3、结果：按《中华人民共和国兽药典(三部)》(2015年版)中“鸡马立克氏病活疫苗(cvi988/rispens株)”的检验标准进行检验，两组冻存的马立克氏病毒均无细菌、支原体、鸡贫血病毒及其他外源病毒污染，安全性和免疫原性均符合要求。分别复苏两组冻存的病毒液，对其蚀斑量进行测定，结果如表格1所示：表格1实施例1和2的病毒收获量测定结果组别病毒接种量病毒收获量实施例17×104pfu/瓶12.8×105pfu/瓶实施例27×104pfu/瓶20.48×105pfu/瓶从表中可以看出，两种接毒方式，接种等量的病毒，培养相同时间后收获，进行蚀斑定量，发现马立克氏病毒均能在鸡胚源df-1细胞系中复制增殖，形成细胞病变，且同步接毒的方式比常规接毒的方法所收获的病毒量更多，因此选用鸡胚源df-1细胞系作为马立克氏病病毒制苗细胞是具有可行性的。实施例3-4：不同接毒方式对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究实施例3-4中采用的培养瓶为spinnerflask，瑞士integra公司生产，工作体积250ml，带有两个磁力搅拌桨。采用的微载体为ge公司生产的cytodex1微载体，1g微载体(干重)含4.26×106个微载体并且能够提供4400cm2的细胞生长面积。微载体的预处理：分别称量100mgcytodex1微载体，放入上述spinnerflask中，加入无ca2+、mg2+的pbs缓冲液浸泡过夜，洗涤三次后，121℃高压灭菌30min，使用前弃去pbs，并加入含体积百分数10％新生牛血清的dmem/f12细胞生长液进行孵育。实施例3：常规接毒组1)鸡胚源df-1细胞系的传代与培养：以鸡胚源df-1细胞系作为制备病毒用细胞；将鸡胚源df-1细胞经0.25％胰酶-edta细胞分散液消化成单个均匀细胞，接种于spinnerflask中的微载体上继续培养，培养温度为37℃；当细胞长成单层时，取样进行计数；2)马立克氏病毒的繁殖：将spinnerflask中的细胞培养液弃去，加入含体积百分数2％新生牛血清的dmem/f12细胞维持液；将病毒接种至步骤1)处理的单层细胞上；加入后，在条件为5％co2、37℃的条件下悬浮培养，培养时进行搅拌：12h内搅拌速度为20rpm，之后调成30rpm，每天观察病变情况；4)病毒的收获：当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒并保存。实施例4：同步接毒组实施例4的特点在于，鸡胚源df-1细胞经消化成单个均匀细胞后，按实施例3细胞长满单层时的细胞数接种鸡胚源df-1细胞于spinnerflask中的微载体上，同时接入病毒，并加入含体积百分数10％新生牛血清的dmem/f12细胞生长液至100ml，在5％co2、37℃的条件下悬浮培养24h；培养时进行搅拌：12h内搅拌速度为20rpm，之后调成30rpm；然后弃去细胞生长液，加入含体积百分数2％新生牛血清的dmem/f12细胞维持液在5％co2、37℃的条件下进行悬浮培养，搅拌速度为30rpm，每天观察病变情况。其余步骤和参数与实施例1相同。对实施例3-4进行检测，结果如表格2所示：表格2实施例3和4的病毒收获量测定结果组别病毒接种量病毒收获量实施例32.0×106pfu/瓶20.48×106pfu/瓶实施例42.0×106pfu/瓶25.6×106pfu/瓶从表中可以看出，利用微载体悬浮系统培养马立克氏病毒，马立克氏病毒同样能在鸡胚源性df-1细胞系中复制增殖，形成细胞病变。其中，同步接毒的方式比常规接毒的方法所收获的病毒量更多，因此采用同步接毒的方式悬浮培养马立克氏病毒比常规的接毒方式效果要好。实施例5：不同细胞接种量对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究实施例5中的spinnerflask，微载体及其处理、鸡胚源df-1细胞系的传代与培养同实施例3-4。1)马立克氏病毒的繁殖：微载体浓度为1g/l，将spinnerflask中的pbs弃去，备4个spinnerflask，分别编号为1-4，分别按微载体和细胞的个数之比1:100/1:150/1:200/1:250进行接种，同时接入cvi988/rispens病毒液2.0×106pfu/瓶，并加入含体积百分数10％新生牛血清的dmem/f12细胞生长液至100ml，在5％co2、37℃的条件下悬浮培养24h；培养时进行搅拌：12h内搅拌速度为20rpm，之后调成30rpm；然后弃去细胞生长液，加入含体积百分数2％新生牛血清的dmem/f12细胞维持液在5％co2、37℃的条件下进行悬浮培养，搅拌速度为30rpm，每天观察病变情况。2)病毒的收获：当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。对实施例5进行检测，结果如表格3所示：表格3实施例5的病毒收获量测定结果从表中可以看出，不同的细胞接种量会影响病毒滴度，当按每个微载体100个df-1细胞接种时，病毒收获量远远低于按150、200、250个df-1细胞接种的组别，而按150、200、250个df-1细胞接种的组别收获的病毒量差别不大，实验时发现当按每个微载体250个df-1细胞接种时，会有大量的细胞处于游离状态，没有更多的表面积供其贴附，因此实际操作中应该按每个微载体150-200个df-1细胞接种为宜。实施例6：不同微载体浓度对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究备3个spinnerflask，分别编号为5-7，分别称量100、250、500mgcytodex1微载体，放入spinnerflask5-7中，加入无ca2+、mg2+的pbs缓冲液浸泡过夜，洗涤三次后，121℃高压灭菌30min，待用。1)马立克氏病毒的繁殖：将spinnerflask中的pbs弃去，分别按微载体和细胞的个数之比1:200进行接种，同时按表格4的接种量接入cvi988/rispens病毒液，并加入含体积百分数10％新生牛血清的dmem/f12细胞生长液至100ml，在5％co2、37℃的条件下悬浮培养24h；培养时进行搅拌：12h内搅拌速度为20rpm，之后调成30rpm；然后弃去细胞生长液，加入含体积百分数2％新生牛血清的dmem/f12细胞维持液在5％co2、37℃的条件下进行悬浮培养，搅拌速度为30rpm，每天观察病变情况。2)病毒的收获：当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。对实施例6进行检测，结果如表格4所示：表格4实施例6的病毒收获量测定结果从表中可以看出，随着微载体浓度的增大，病毒的收获总量增大，但是也没有按照比例增加，可能是由于随着微载体浓度的增加，微载体之间碰撞几率增加，剪切力增加，同时微载体浓度越大，细胞越多，对于培养条件的要求也更严苛。因此，随着微载体浓度的增大，病毒收获的总量比低浓度微载体培养时更多，但并没有按照比例增加。实施例7：不同培养系统培养马立克氏病毒的比较将采用鸡胚源df-1细胞悬浮培养马立克氏病毒(实施例6的7号瓶)和利用cef在t225方瓶中培养马立克氏病毒进行比较。利用cef细胞在t225细胞培养瓶中培养马立克氏病毒的步骤：采用常规方法制备鸡胚成纤维细胞，按1.8×106cells/ml接种至t225细胞培养瓶，加入细胞生长液50ml；置于37℃培养箱中培养24h至长满良好单层，弃去旧培养液，按照鸡胚源df-1细胞悬浮培养相同的病毒细胞比例接种cvi988/rispens病毒，补加细胞维持液至50ml，37℃培养箱中培养。当接入的细胞病变率达80％以上时，收获病毒液并保存。将两者进行比较，结果如表格5所示：表格5不同培养系统培养马立克氏病毒的比较本实施例中，spinnerflask的培养体积为100ml，添加微载体500mg，其中1g微载体能提供4400cm2的细胞贴壁面积，若要达到和spinnerflask相同的贴壁面积则需要10个t225细胞培养瓶，而且利用df-1微载体悬浮培养马立克氏病毒与采用cef细胞在t225细胞培养瓶中收获的量相当。采用微载体悬浮培养马立克氏病毒操作简便，稳定性强，不仅能够消除常规疫苗生产中存在的生物安全隐患，同时用传代细胞系代替原代鸡胚成纤维细胞培养马立克氏病毒，还能克服传统疫苗生产受制于鸡胚的供应的缺点，也避免了感染外源病毒的风险。当然，在规模化生产当中，悬浮培养的体积远不止100ml，随着悬浮培养技术的进步，现在悬浮培养已经达到了几十，几百甚至几千升的培养规模，因此本发明也为大规模培养马立克氏病毒的技术奠定了基础。对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页12