CAR.IL‑33‑T及其制备与应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种car.il-33-t及其制备与应用。
背景技术：
：嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor,car)修饰t细胞(car-t细胞治疗技术)是近年来发展非常迅速的一种过继免疫细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应t细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均优于常规应用的免疫细胞，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，是肿瘤免疫细胞治疗领域中新的靶向治疗方式。car-t细胞治疗技术的特点在于将抗体的靶向特异性与t细胞的归巢、组织穿透和靶向摧毁能力结合起来用于肿瘤治疗，并在过去的十年中取得了飞速发展，在多种恶性肿瘤的基础研究及临床转化中均取得了显著疗效，多个临床试验结果也令人振奋。car-t技术将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部与cd3-ζ链或fcεriγ的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导患者t细胞，使其表达嵌合抗原受体，患者的t细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的car-t细。根据胞内区的结构不同，可将car-t划分为三代：第一代car-t(cfv+信号传导部分)虽然能够介导对肿瘤细胞的杀伤作用，但是不转导增殖信号和诱导细胞因子产生，并且体内持续作用时间不长；第二代car-t通过增加共刺激分子(例如cd28)的胞内结构域以延长其体内存活时间，促进其迅速扩增能力，通过构建scfv/fc/cd28/cd3-ζ的car-t可以裂解靶细胞，且不需要b7与cd28的作用，仅靠单一分子就可以传递活化信号，产生大量的ifn-γ、il-2等细胞因子；第三代car-t增加了更多的共刺激信号结构域(通常是肿瘤坏死因子受体家族成员)，例如4-1bb(又称cd137)、ox40(又称cd134)、cd27、可诱导共刺激分子(inducibleco-stimulatorymolecule，icos)等，第三代car-t较第二代具有更好的增强t细胞活化、扩增、抗肿瘤以及促进转基因表达的能。目前成功运用于临床的car-t细胞种类主要包括cd19-car-t、her-2/neu-car-t等，世界范围内多个中心正在进行靶向不同肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)的car-t细胞治疗临床研究，包括靶向cd133、cd138、cd20、cd30、egfr、c-met等。目前实体瘤缺乏好的靶点，主要是由于实体瘤细胞的异质性，所以通过大量的临床标本收集和验证，找到更为特异性的实体瘤靶点是当前car-t细胞治疗领域的一个重要方向。我们团队先后构建靶向肿瘤抗原cea、muc-1等car-t细胞，初步建立了car-t细胞制备的技术平台，进行了系列临床前研究。肿瘤免疫治疗通过提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫应答水平，从而控制和杀伤肿瘤细胞，肿瘤免疫治疗作为抗肿瘤的最佳方法也在越来越多的临床应用中得到验证。然而，肿瘤微环境的免疫抑制仍是影响免疫治疗疗效的主要因素，肿瘤发生进展过程中缺乏适当的“危险信号”来触发和维持肿瘤监视及抗肿瘤免疫应答。技术实现要素：鉴于现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种表达靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体并能够分泌白介素-33的t细胞及其制备与应用。为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种嵌合抗原受体t细胞，其表达靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)和白介素-33(il-33)。优选地，靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)表达于t细胞膜上。优选地，白介素-33(il-33)表达分泌于t细胞膜外。优选地，所述靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体包括依次连接的结合肿瘤抗原的多肽、cd28跨摸区(cd28-tm)、胞内4-1bb及胞内cd3ζ。优选地，所述肿瘤抗原为癌胚抗原(cea)。优选地，所述结合癌胚抗原的多肽为抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)。优选地，所述抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)包括轻链可变区和重链可变区。优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.11所示。优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如seqidno.12所示。本发明一些实施例中，列举了所述抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)的氨基酸序列seqidno.10所示。优选地，所述cd28跨膜区的氨基酸序列如seqidno.13所示。优选地，所述胞内cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.14所示。优选地，所述胞内4-1bb的氨基酸序列如seqidno.15所示。优选地，所述结合肿瘤抗原(cea)的多肽与cd28跨膜区(cd28-tm)之间通过连接片段连接。所述连接片段的氨基酸数量可为≥2个。优选地，所述连接片段为免疫球蛋白igd的铰链区片段。进一步优选地，所述连接片段为免疫球蛋白igg4铰链区片段。优选地，所述免疫球蛋白igg4铰链区片段的氨基酸序列如seqidno.16所示。所述连接片段可通过二硫键相互连接形成二聚体。优选地，所述结合肿瘤抗原(cea)的多肽的c末端与所述cd28跨膜区(cd28-tm)的n末端连接。本发明一些实施例中，列举了所述靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体的氨基酸序列如seqidno.9所示。本发明一些实施例中，列举了白介素-33(il-33)的氨基酸序列如seqidno.20所示。本发明的第二方面，提供了一种制备前述嵌合抗原受体t细胞的方法，包括步骤：(1)构建融合了白介素-33的靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体表达载体；(2)将步骤(1)所述表达载体转化至t细胞中诱导表达，获得表达靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体(car)和白介素-33(il-33)的嵌合抗原受体t细胞。优选地，步骤(1)中，所述表达载体中含有融合了白介素-33的靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸序列。优选地，所述融合了白介素-33的靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸，是在靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸的c端依次融合了t2a编码多核苷酸和白介素-33(l-33)编码多核苷酸。优选地，所述肿瘤抗原为癌胚抗原。优选地，靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体的编码多核苷酸序列如seqidno.8所示。优选地，所述t2a的编码多核苷酸的序列如seqidno.17所示。优选地，所述白介素-33的编码多核苷酸的序列如seqidno.18所示。优选地，融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸的序列如seqidno.19所示。本发明的第三方面提供了一种多核苷酸，为融合了白介素-33的靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸。优选地，所述融合了白介素-33的靶向于肿瘤抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸，是在靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸的c端依次融合了t2a编码多核苷酸和白介素-33(l-33)编码多核苷酸。优选地，所述肿瘤抗原为癌胚抗原。优选地，靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体的编码多核苷酸序列如seqidno.8所示。优选地，所述t2a的编码多核苷酸的序列如seqidno.17所示。优选地，所述白介素-33的编码多核苷酸的序列如seqidno.18所示。优选地，融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体编码多核苷酸的序列如seqidno.19所示。本发明第四方面提供了一种表达载体，其含有所述多核苷酸。本发明第五方面提供了一种宿主细胞，其被所述表达载体所转化。本发明的第六方面，提供了前述嵌合抗原受体t细胞在制备肿瘤治疗药物中的用途。本发明的第七方面，提供一种肿瘤治疗药物，其含有所述嵌合抗原受体t细胞。本发明的第九方面，提供一种肿瘤治疗方法，包括步骤：将所述嵌合抗原受体t细胞施用于肿瘤患者。优选地，所述肿瘤为癌胚抗原高表达的肿瘤。例如：结肠癌、肠癌、胃癌肝转移及胰腺癌。与现有技术相比，本发明的有益效果为：肠癌、胃癌肝转移及胰腺癌等恶性实体肿瘤的治疗仍是肿瘤治疗的难点，虽然手术治疗、放化疗、介入治疗等有一定疗效，但患者生存率仍无显著改善。目前，备受关注的car-t细胞治疗技术有望成为该类肿瘤治疗的突破口。本发明根据该类肿瘤特异性高表达cea肿瘤抗原的特点，设计靶向识别cea的特异性抗体，采用第二代car骨架作为载体，设计cea.car和cea.car.il-33。并培养扩增了cea.car和cea.car.il-33-t细胞，并通过一系列体外及体内试验，证实我们自行设计的cea.car-t细胞可以特异性识别并杀伤cea高表达的人肿瘤细胞系及移植瘤模型，与cea.car-t细胞相比，cea.car.il-33-t细胞有更强的杀瘤功能。并证实cea.car.il-33-t细胞是一种安全、特异、有效的car-t细胞，具有重要的临床应用价值。附图说明图1：cea.car的结构示意图。图2：cea.car和cea.car.il-33的整个表达框结构示意图。图3a：流式结果显示，在ifn-γ刺激前后，lovo细胞都高表达cea。图3b：elisa结果显示，和其他肿瘤细胞与cart共培养上清相比，lovo与cea嵌合cd4+t细胞或cea嵌合cd8+t细胞共育后ifn-γ分泌最高。图3c：cea.car-t(bfp+)与lovo细胞共育后，t细胞活化标记分子(cd69)上调。图4：lovo-nsg小鼠模型显示，cea.car-t有效抑制肿瘤生长，与cea.car-t细胞相比，cea.car.il-33-t细胞有更强的杀瘤作用。具体实施方式car-tcar-t，全称是chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。嵌合抗原受体chimericantigenreceptor(car)。白介素-33(interleukin-33,il-33)白介素-33(interleukin-33,il-33)作为白介素-1(il-1)家族的一个重要成员。il-33可通过损伤/感染的组织细胞或活化巨噬细胞释放，作为一种内源性的“危险信号”来触发炎症和细胞介导的免疫应答。上调肿瘤微环境中il-33的表达可以显著增加了肿瘤组织中浸润cd8+t细胞及nk细胞的比率并增强其效应功能，而il33的下调表达对肿瘤免疫逃避至关重要，是导致肿瘤“免疫忽视”的重要机制。前期研究已证实il-33受体st2表达于cd8+t细胞、th1细胞、nk和nkt细胞上，这表明il-33/st2在i型抗肿瘤免疫应答中具有重要作用。与此同时，tme中上调il-33可显著阻止肿瘤生长，增加了肿瘤组织中浸润cd8+t细胞及nk细胞的比率，并促进肿瘤浸润cd8+t和nk细胞的ifn-γ分泌，增强其效应功能。我们提出联合car和il-33可以有效向肿瘤部位输送il-33，增强car-t细胞的抗肿瘤功能。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。实施例1靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达载体的构建及融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达载体的构建本发明中，靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体可简称为cea.car。本发明的中，融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体可简称为cea.car.il-33。本发明中，如图1所示，cea.car由依次连接的结合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨摸区(cd28-tm)、胞内4-1bb及胞内cd3ζ融合而成。其中，结合癌胚抗原(cea)的多肽为抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)。所述单链抗体包括轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)。所述轻链可变区(vl)的编码核苷酸序列如seqidno.1所示，具体为：gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa。所述重链可变区(vh)的编码核苷酸序列如seqidno.2所示，具体为：agcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。所述抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)的编码核苷酸序列如seqidno.3所示，具体为：gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca。cd28跨膜区(cd28-tm)的编码核苷酸序列如seqidno.4所示，具体为：atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtg。胞内4-1bb的编码核苷酸序列如seqidno.5所示，具体为：cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg。胞内cd3ζ的编码核苷酸序列如seqidno.6所示，具体为：cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。结合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨摸区(cd28-tm)之间免疫球蛋白igg4铰链区片段作为连接片段连接。所述免疫球蛋白igg4铰链区片段的编码核苷酸序列如seqidno.7所示，具体为：gagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaag。为了便于对cea.car的识别，在胞内cd3ζ的c端连接了t2a-tagbfp。委托公司合成cea.car的整个表达框，如图2所示，插入pcart-ef1a-scfv-car框载体(购自上海吉凯公司)，经测序正确后，使用qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。经测序可知，cea.car的全长基因序列正确，均与预期相符。具体地，cea.car的编码核苷酸序列如seqidno.8所示，具体为：atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgcgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg。采用现有技术，对重组表达载体的高品质质粒转至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离纯化获得cea.car。对获得的cea.car经n/c末端序列分析，结果表明所表达的cea.car均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致。因此，可得知，cea.car的氨基酸序列如seqidno.9所示，具体为：metdtlllwvlllwvpgstgdtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleikgstsgggsgggsggggssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvsseskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkmfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprl。抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)的氨基酸序列如seqidno.10所示，具体为：dtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleikgstsgggsgggsggggssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvss。抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.11所示，具体为：dtlllwvlllwvpgstgdivltqspaslavslgqratmscragesvdifgvgflhwyqqkpgqppklliyrasnlesgipvrfsgtgsrtdftliidpveaddvatyycqqtnedpytfgggtkleik。抗癌胚抗原(cea)的单链抗体(scfv)的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.12所示，具体为：ssevqlqqsgaelvepgasvklsctasgfnikdtymhwvkqrpeqglewigridpangnskyvpkfqgkatitadtssntaylqltsltsedtavyycapfgyyvsdyamaywgqgtsvtvss。cd28跨膜区(cd28-tm)的氨基酸序列如seqidno.13所示，具体为：mfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv。胞内4-1bb的氨基酸序列如seqidno.14所示，具体为：rfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。胞内cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.15所示，具体为：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr。结合癌胚抗原(cea)的多肽、cd28跨膜区(cd28-tm)之间免疫球蛋白igg4铰链区片段作为连接片段连接。所述免疫球蛋白igg4铰链区片段的氨基酸序列如seqidno.16所示，具体为：eskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk。如图2所示，cea.car.il-33是在cea.car.的胞内cd3ζ的c端连接了t2a-il-33。t2a的编码多核苷酸的序列如seqidno.17所示，具体为：gagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgc。human分泌型il-33的编码多核苷酸序列如seqidno.18所示，具体为：atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctagccttgctgctccacgccgccaggccgagtatcacaggaatttcacctattacagagtatcttgcttctctaagcacatacaatgatcaatccattacttttgctttggaggatgaaagttatgagatatatgttgaagacttgaaaaaagatgaaaagaaagataaggtgttactgagttactatgagtctcaacacccctcaaatgaatcaggtgacggtgttgatggtaagatgttaatggtaaccctgagtcctacaaaagacttctggttgcatgccaacaacaaggaacactctgtggagctccataagtgtgaaaaaccactgccagaccaggccttctttgtccttcataatatgcactccaactgtgtttcatttgaatgcaagactgatcctggagtgtttataggtgtaaaggataatcatcttgctctgattaaagtagactcttctgagaatttgtgtactgaaaatatcttgtttaagctctctgaaacttag。委托公司合成cea.car.il-33的整个表达框，如图2所示，插入慢病毒载体(购自上海吉凯公司)，经测序正确后，使用qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。经过测序可知，cea.car.il-33的全长编码基因正确，均与预期相符。具体地，cea.car.il-33的编码核苷酸序列如seqidno.19所示，具体为：atggagacagacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgcagagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccctgtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggaggctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttccggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagagagcaagtacggccctccctgccccccttgccctgcccccgagttcctgggcggacccagcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagccggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaacagcacctaccgggtggtgtctgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagaatacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagcagcatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgagccccaggtgtacaccctgcctccctcccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgcctggtgaagggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaacggccagcctgagaacaactacaagaccacccctcccgtgctggacagcgacggcagcttcttcctgtacagccggctgaccgtggacaagagccggtggcaggaaggcaacgtctttagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtccctgggcaagatgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgcgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaaggctcgagggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctcgcatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctagccttgctgctccacgccgccaggccgagtatcacaggaatttcacctattacagagtatcttgcttctctaagcacatacaatgatcaatccattacttttgctttggaggatgaaagttatgagatatatgttgaagacttgaaaaaagatgaaaagaaagataaggtgttactgagttactatgagtctcaacacccctcaaatgaatcaggtgacggtgttgatggtaagatgttaatggtaaccctgagtcctacaaaagacttctggttgcatgccaacaacaaggaacactctgtggagctccataagtgtgaaaaaccactgccagaccaggccttctttgtccttcataatatgcactccaactgtgtttcatttgaatgcaagactgatcctggagtgtttataggtgtaaaggataatcatcttgctctgattaaagtagactcttctgagaatttgtgtactgaaaatatcttgtttaagctctctgaaacttag。采用现有技术，对重组表达载体的高品质质粒转至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离纯化获得cea.car和il-33。对获得的cea.car和il-33经n/c末端序列分析，表明所表达的cea.car和il-33均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致。其中，cea.car的氨基酸序列如seqidno.9所示。human分泌型il-33的氨基酸序列如seqidno.20所示，具体为：malpvtalllplalllhaarpsitgispiteylaslstyndqsitfaledesyeiyvedlkkdekkdkvllsyyesqhpsnesgdgvdgkmlmvtlsptkdfwlhannkehsvelhkcekplpdqaffvlhnmhsncvsfecktdpgvfigvkdnhlalikvdssenlctenilfklset。实施例2靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒制备及融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒制备一、制备慢病毒1.目的：介绍生产和浓缩用于后续哺乳动物细胞转导的慢病毒的方法。2.设备和材料*dmem“完全”培养基为加入10％热灭活fbs的dmem培养基。在silverlab中，我们还添加了100u/ml青霉素-链霉素。§若无热灭活fbs，可将常规fbs置于56℃水浴30分钟，完全解冻以热灭活fbs。3.步骤注意事项：传统的病毒制备需要8个10厘米培养皿。可根据需要进行调整。此过程中，同时制备3种病毒，每种病毒需要8个10厘米培养皿。3.1准备hek293t：3.1.1.准备制备慢病毒时，提前3天将hek293t细胞传代接种于t-150培养瓶中。hek293t细胞培养方法如下(注意：尽量缩短细胞在浓缩胰蛋白酶中和培养箱外面的时间)：3.1.1.1.将培养瓶中的培养基吸净，弃掉。3.1.1.2.向每个t-150培养瓶中加入2ml0.25％胰蛋白酶，并倾斜培养瓶以确保胰蛋白酶覆盖整个瓶底。3.1.1.3.37℃孵育2-3分钟。3.1.1.4.检查细胞是否已从瓶底脱落；可倾斜培养瓶以促进细胞消化脱落。3.1.1.5.待细胞消化脱落后，向每个培养瓶中加入10mldmem完全培养基，并用移液管充分混合，以确保细胞完全悬浮于溶液中。3.1.1.6.将10μl细胞悬浮液转移至600μl离心管中，并加入90μl培养基稀释、混匀。3.1.1.7.从上述1：10稀释过的细胞悬液中取出15μl并与15μl台盼蓝混合，计数并计算出细胞密度。3.1.1.8.以5×106个/20ml培养基的细胞密度将细胞接种于t-150培养瓶中(3天后每个t-150培养瓶中的细胞数量可达到45-60×106)。3.1.1.9.将培养瓶平放于的co2培养箱中。3.1.2.培养72小时后，观察细胞生长情况，若细胞密度达到80-90％，细胞状态良好(细胞明亮，紧密附着于瓶底，细胞边缘平整等)。则可用于后续慢病毒制备。3.2.慢病毒制备的第1天：注意：由于需要先等细胞粘附于培养皿底部才可开始进行calphos转染，而这一过程大概需要需要4-6小时。因此要在慢病毒制备的第1天尽早将细胞接种于10cm培养皿中。注意：或者，可在转染前24小时按照3.5×106个/9ml密度接种于10cm培养皿中。3.2.1.制备一种慢病毒，需要8个10cm细胞培养皿，并标明日期、姓名和质粒id号。3.2.2.如3.1.1.1-3.1.1.7所述，将hek293t细胞用胰蛋白酶消化，dmem完全培养基终止消化并计数。3.2.3.确定慢病毒制备所需的细胞数量：7×106个细胞/皿，8个皿/病毒。3.2.4.实际收取的细胞要比以上所需细胞数量多3.5×106个，以防损耗(例如，制备2种病毒需实际收取171.5×106，每种病毒8个培养皿的细胞)。3.2.5.加入适量的培养基使最终浓度为7×106个细胞/9ml。3.2.6.将9ml细胞悬浮液等分到每个标记好的10cm培养皿中。3.2.7.将每个培养皿平放于生物安全柜上，沿前后左右轻轻地来回移动，以使细胞均匀铺于皿底。3.2.8.将培养皿放回培养箱。勿将多个培养瓶罗放于培养箱中。由于细胞的生长状况不同，细胞密度达到80％大概需要3-6个小时。之后，便可开始进行calphos转染。3.2.9.按下表计算所需的试剂体积。试剂每个培养皿需要的量构建的质粒dna15μg病毒载体pcmv-rev2(ps013)1μg病毒载体pchgp-2(ps014)10μg病毒载体pcmv-g(ps015)2μg2mcacl262μl无菌水总体积为500μl3.2.10.按照以下顺序将无菌水(来自calphos转染试剂盒)，质粒dna和2mcacl2溶液(来自calphos转染试剂盒)加入15ml离心管中，并充分混合。3.2.11.按照平均每个反应体系500μl2xhbs，将适量的2xhbs加入50ml离心管中，适当增加体积，避免损耗(例如，8个培养皿反应体系可共加4100μlhbs)。3.2.12.使用1ml移液枪，将等体积的dna/cacl2混合物逐滴加入hbs中，滴加的同时轻轻晃动hbs管。3.2.13.将混合物在室温下孵育20分钟。待孵育即将结束时，取出早上铺好的293t细胞。3.2.14.用1ml移液枪上下吹打混合hbs/cacl2/dna溶液。3.2.15.将1ml溶液逐滴滴加到每个培养皿中。3.2.16.重复步骤3.2.7，充分混匀。3.2.17.处理完所有培养皿后，将培养皿放入培养箱过夜孵育，不超过18小时即可进行下一步实验。3.3.慢病毒制备的第2天(取出calphos成分)3.3.1.按照如下操作准备0.6m丁酸钠溶液：3.3.1.1.将3.3027g丁酸钠(sigma，货号b5887-5g)溶于50mlh2o中。0.22-μm真空过滤器灭菌。室温储存。3.3.2.除去calphos成分(对细胞有毒)，并在转染后18小时内更换培养基。3.3.2.1.配制第2天所需培养基：245mldmem完全培养基中加入2.45ml0.6m丁酸钠。(注意：本实验中共24个培养皿，每个培养皿中加入10ml培养基，可适当调整。)3.3.2.2.将上述培养基及不含镁、钙的1xpbs预热至37℃。3.3.2.3.为避免细胞在培养箱外面呆的时间过长，可一次性取出两块培养皿依次进行处理。3.3.2.4.在培养皿的中央标记一条线来区分移除和加入培养基的部位，以减少对其他部位细胞的伤害。3.3.2.6.用10ml移液管和移液器放置缓慢，轻轻吸除培养基。3.3.2.7.旋转培养皿，将吸除培养基的位置转到对侧，用10ml移液管沿培养皿的上缘缘缓慢加入5ml上述预热的pbs。使培养基可沿培养皿底面缓缓流下。3.3.2.8.沿前后左右来回移动培养皿(如步骤3.2.7所示)以彻底冲洗。然后旋转培养皿，在吸除培养基的位置吸除pbs洗涤液。3.3.2.9.缓缓加入10ml步骤3.3.2.1中制备的含有丁酸钠的dmem完全培养基。3.3.2.10.将培养皿回培养箱。3.3.2.11.按照步骤3.3.2.3-3.3.2.9处理其余的培养皿。3.4生产慢病毒的第三天(一代收集和peg处理)3.4.1收集病毒上清(24小时后换液)3.5病毒重悬3.5.8.1将收集到的病毒每盘加入50μ无血清的1640。不要用移液管上下混匀。3.5.8.2将超净管用封口膜封口，在振荡器上震动若干秒将其完全重悬。3.5.8.3将其在4摄氏度环境中静置30min-1h，每份病毒在其v底冷冻管上做标记。3.5.8.4将病毒悬液在振荡器上震荡混匀至没有明显团块。(超速离心后溶液及时没有明显沉淀也是浓稠的)。3.5.8.5将同一种病毒的重悬液加在同一个管子中。3.5.8.6将空的超净管放入50ml离心管中，震动15sec将参与病毒上清移到管底。3.5.8.7将3.4.4.5中的上清转移到一个总收集管中。3.5.8.8将上清震荡使其均匀。3.5.8.9将一份上清转移到v底冻存管中(每份大约25-50μl)。3.5.9将每份病毒贮存于-80℃。二、慢病毒滴定1.目的：介绍评估慢病毒转导效率的方法2.设备和材料*dmem“完全”培养基为加入10％热灭活fbs的dmem培养基。在silverlab中，我们还添加了100u/ml青霉素-链霉素。§若无热灭活fbs，可将常规fbs置于56℃水浴30分钟，完全解冻以热灭活fbs。3.步骤第1天注意：以最高病毒输入量额外转染几个孔用于长期培养和冷冻保存注意：空载体转导的细胞作阴性对照1.每孔用0.5mlrpmi完全培养基将0.1×106个jurkat细胞接种至24孔板中。2.每孔按照1：1000加入聚凝胺(4mg/ml)(例如0.5ml培养基中加入0.5μl4ml/ml的聚凝胺)。3.复苏病毒4.用rpmi完全培养基，1：1000稀释浓缩病毒。5.以下列浓度将病毒加入每个孔中。a.加入50ul1：1000稀释的病毒(最终的病毒体积：5×10-5ml)b.加入0.5ul未稀释病毒(最终的病毒体积：5×10-4ml)c.加入1ul未稀释的病毒(最终的病毒体积:为1×10-3ml)d.加入5ul未稀释的病毒(最终的病毒体积：5×10-3ml)6.37℃过夜孵育。第2天每个孔中加入0.5ml新鲜的rpmi完全培养基以稀释聚凝胺。第3天1.收集样品并利用流式细胞术进行检测以分析基因的表达。2.以最高病毒输入量额外转染几个孔用于长期培养和冷冻保存滴度计算：注意：滴度计算的线性范围是15％-45％载体表达率。最终，经计算获得靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒及融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒的滴度符合要求。实施例3t细胞的体外培养、遗传修饰和扩增采用实施例2制备的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒慢病毒及融合了白介素-33的靶向于癌胚抗原的嵌合抗原受体表达慢病毒转导人t淋巴细胞：1.将pbmc接种于24孔板的3个孔中，每孔500万个细胞，1mlrpmi。2.每孔加入1ug/mlokt3和1：1000稀释的il2刺激细胞。3.37℃孵育24h。4.6ml病毒上清液中加入6ul聚凝胺(4mg/ml)，混匀。5.每孔加入2ml病毒/聚凝胺混合物。6.1800r/s，离心50分钟。7.每孔吸除2/3上清液；并向每个孔中加入2ml病毒/聚凝胺混合物和1:1000稀释的il2。8.37℃孵育过夜。9.吸除2/3上清液；并向每个孔中加入2ml新鲜rpmi和1：1000稀释的il2。10.37℃孵育过夜。11.收集样品并利用流式细胞术进行检测(cd4，cd8，tim3)以分析目的基因表达情况。从中筛选出成功进行了遗传修饰的t细胞，亦即cea.car-t及cea.car.il-33-t。接下来cea高表达细胞株lovo的鉴定及与cea-car-t共培养，观察cea-car-t细胞效应功能的变化：图3a.在ifn-γ刺激或不刺激的情况下，facs检测结果显示与293t、ht-29、caco2和a375相比，lovo细胞中cea呈高表达。图3b.与293t，ht-29，caco2和a375组相比，cea.car-t与lovo共培养时，cd4和cd8亚群中ifn-γ产生显著增加。图3c.构建并浓缩高滴度复制缺陷型慢病毒载体。在转染前24小时，将11-12×106的293t人胚胎肾细胞用10cm培养板铺板。慢病毒载体纯化后采用脂质体法转染293t细胞，转染24和48小时后收集培养上清。采用转染cea.car的jurkat与lovo进行共培养杀伤实验，结果表明共培养8h后，jurkat细胞中cd69分子表达水平显著上调。实施例4体内试验验证cea.car-t和cea.car.il-33-t细胞的抗肿瘤作用选用实施例3中所构建的cea.car-t细胞和cea.car.il-33-t细胞，采用人肠癌细胞株lovo在nsg小鼠中构建移植瘤模型，体内试验探讨cea.car-t在肠癌模型治疗中的作用。如图4所示，9只nsg小鼠皮下接种5x106人肠癌细胞株lovo，3只小鼠在第14天接种6x106的cea.car-t细胞，3只小鼠在第14天接种6x106的cea.car.il-33-t细胞，3只小鼠在第14天接种pbs，每2天测量肿瘤大小。lovo-nsg小鼠模型显示，ceacart有效抑制肿瘤生长。和cea.cart细胞比，cea.car.il-33-t细胞更有效抑制肿瘤生长。本发明还尝试过将cea.car上的抗cea的抗体替换成其他针对该抗原的抗体，来制备其他car-t，结果各方面的效果没有本发明的cea.car-t效果好。以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。sequencelisting<110>常州市第一人民医院<120>car.il-33-t及其制备与应用<130>172304<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>384<212>dna<213>artificial<220><223>轻链可变区（vl）的编码核苷酸序列<400>1gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtg60ctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgc120agagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaa180ccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccct240gtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggag300gctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcgga360ggggggaccaagctggaaataaaa384<210>2<211>369<212>dna<213>artificial<220><223>重链可变区（vh）的编码核苷酸序列<400>2agcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagccaggggcctcagtc60aagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatgcactgggtgaag120cagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcgaatggtaatagt180aaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacacatcctccaacaca240gcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctattattgtgctccg300tttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaaggaacctcagtcacc360gtctcctca369<210>3<211>801<212>dna<213>artificial<220><223>抗癌胚抗原（cea）的单链抗体（scfv）的编码核苷酸序列<400>3gacacactcctgctatgggtgctgctgctctgggttccaggttccacaggtgacattgtg60ctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctcttgggcagagggccaccatgtcctgc120agagccggtgaaagtgttgatatttttggcgttgggtttttgcactggtaccagcagaaa180ccaggacagccacccaaactcctcatctatcgtgcatccaacctagaatctgggatccct240gtcaggttcagtggcactgggtctaggacagacttcaccctcatcattgatcctgtggag300gctgatgatgttgccacctattactgtcagcaaactaatgaggatccgtacacgttcgga360ggggggaccaagctggaaataaaaggcagtactagcggcggtggctccgggggcggttcc420ggtgggggcggcagcagcgaggttcagctacaacagtctggggcagagcttgtggagcca480ggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaagacacctatatg540cactgggtgaagcagaggcctgaacagggcctggaatggattggaaggattgatcctgcg600aatggtaatagtaaatatgtcccgaagttccagggcaaggccactataacagcagacaca660tcctccaacacagcctacctgcagctcaccagcctgacatccgaggacactgccgtctat720tattgtgctccgtttggttactacgtgtctgactatgctatggcctactggggtcaagga780acctcagtcaccgtctcctca801<210>4<211>84<212>dna<213>artificial<220><223>cd28跨膜区（cd28-tm）的编码核苷酸序列<400>4atgttctgggtgctggtggtggtgggcggggtgctggcctgctacagcctgctggtgaca60gtggccttcatcatcttttgggtg84<210>5<211>141<212>dna<213>artificial<220><223>胞内4-1bb的编码核苷酸序列<400>5cgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccattt60atgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaa120gaagaaggaggatgtgaactg141<210>6<211>336<212>dna<213>artificial<220><223>胞内cd3ζ的编码核苷酸序列<400>6cgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctg6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