二价铜离子荧光探针及其制备方法和用途与流程

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种黄酮化合物作为二价铜离子荧光探针的制备方法及其用途。

背景技术：

重金属污染一直以来都备受关注。常见的污染成分之一金属铜，主要来源于工业三废、汽车尾气、农药化肥等，其离子存在形式主要为二价铜离子。对人体而言，铜是体内重要的微量元素，铜离子对于维持和调节机体正常代谢都起着至关重要的作用，浓度过高或过低都会扰乱生命系统的正常活动而使细胞中毒，引起严重的铜代谢障碍疾病。例如，人体如果摄入过多的铜，造成体内铜离子的浓度过高,易引发一系列的疾病，例如威尔逊氏症、阿尔茨海默症、家族性肌萎缩侧索硬化症、帕金森综合症等，因此对日常食物、土壤及水体等生活环境中的铜离子进行安全检测具有重要意义。

目前常用的检测铜离子方法有分光光度法、原子吸收法、电化学方法、元素分析及等离子体-质谱等方法，但在运用这些检测方法时，往往存在对样品的预处理比较复杂、耗时长等问题，并且无法实现在生物体内对铜离子的在线分析。

荧光分析检测方法能够基本克服上述问题，具有快速简便、检测灵敏等特点，并且可以在生物体内实现对铜离子的成像分析，具有重要的应用前景。目前二价铜离子荧光探针存在着探针种类较少、合成制备步骤繁琐及检测特异性不够等问题。因此，开发新型二价铜离子荧光探针有着重要的研究与应用价值。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种结构新颖、合成制备简便的黄酮化合物，作为一类新型、具有高检测特异性的二价铜离子荧光探针。

本发明的技术方案是，一种二价铜离子荧光探针，所述二价铜离子荧光探针为3-o-皮考林酰基-4’-二乙胺基黄酮，其结构为：

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所提供一类黄酮类化合物作为结构新型的二价铜离子荧光探针；

本发明荧光探针可对二价铜离子进行快速检测，选择性好，抗其他金属离子干扰能力强。测试样品无需前处理或前处理非常简单；

本发明荧光探针自身荧光比较微弱，与二价铜离子作用后，溶液荧光信号明显增强；

本发明荧光探针在水体系或有机溶剂-水混合体系溶液颜色近于无色，与二价铜离子作用后，颜色变深黄，是一种具有生色传感功能的荧光探针，对样品可进行目视定性检测；

本发明的二价铜离子荧光探针性能优异，是一种简单、快速、灵敏的二价铜离子特异性检测试剂，可对样品进行定性、定量及成像检测，具有广阔的应用前景。

进一步的，所述二价铜离子荧光探针制成药物学上可接受的盐；所述药物学上可接受的盐为锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐。

进一步的，所述有机铵盐为甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐或n,n-二异丙基乙胺盐。

二价铜离子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：常温下，将2’-羟基苯乙酮和4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛溶于乙醇，以10％naoh为催化剂，反应后纯化分离得到中间体查尔酮；

步骤二：加入30％h2o2氧化中间产物查尔酮，得到中间体3-羟基黄酮；

步骤三：常温下，将3-羟基黄酮、edci、dmap与皮考林酸溶于二氯甲烷，发生缩合反应，经柱层析纯化分离得到二价铜离子荧光探针。

作为制备方法的优选，所述2’-羟基苯乙酮和4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛的物质的量比为1：1.2～2。

作为制备方法的进一步优选，所述3-羟基黄酮、edci和皮考林酸的物质的量比为1：1.2～1.5：1.2～1.5。

其中edci为碳化二亚胺，dmap为4-二甲氨基吡啶，本发明所提供制备方法原材料易得，合成路线简单，易于制备，只需要三步就可以完成，产物纯化处理过程简单，容易操作，便于推广应用；

二价铜离子荧光探针的用途一：用于水环境和生物细胞体系中二价铜离子的含量检测；所述的检测包括荧光检测，目视定性检测和细胞成像检测。

二价铜离子荧光探针的用途二：将所述二价铜离子荧光探针应用于检测二价铜离子。

二价铜离子荧光探针的用途二：所述二价铜离子荧光探针应用于制备二价铜离子检测试剂及检测试剂盒。

本发明应用时，二价铜离子可识别和结合该荧光探针上的3-皮考林酸酯基，进而催化酯基的水解，生成有强烈荧光的3-羟基黄酮产物，发射的荧光强度与二价铜离子含量成正比，另外在日光条件下，通过肉眼即可明显观察到检测液前后由无色变成黄色的颜色变化。该荧光探针可对二价铜离子进行快速检测，选择性好，抗其他金属离子干扰能力强，可广泛应用于水溶液中二价铜离子含量的检测，目视定性检测以及在生物细胞内二价铜离子的成像检测。本发明是一种简单，快速，灵敏的二价铜离子特异性检测试剂，在分析检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中荧光探针检测二价铜离子的荧光强度随时间的变化图；

图2为本发明实施例3中荧光探针与不同浓度的二价铜离子反应的荧光反射光谱图；

图3为本发明实施例4中荧光探针对二价铜离子在白光、紫外365nm条件下的可视化检测图；

图4为本发明实施例5中荧光探针与常见离子反应后的荧光强度及可视化检测图；

图5为本发明实施例6中荧光探针对细胞外源性二价铜离子的荧光成像图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

本发明实施例提供二价铜离子荧光探针，所述荧光探针为述荧光探针为3-o-皮考林酰基-4’-二乙胺基黄酮，其结构式为：

其中，二价铜离子荧光探针可以制备成药物学上可接受的盐；所述药物学上可接受的盐为锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐、铜盐、有机铵盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙二酸盐或柠檬酸盐；有机铵盐包括甲胺盐、乙胺盐、三乙基胺盐或n，n—二异丙基乙胺盐。

实施例1

本发明实施例二价铜离子荧光探针的的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：常温下，将2’-羟基苯乙酮和4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛溶于乙醇，以10％naoh为催化剂，反应后纯化分离得到中间体查尔酮1；

步骤二：加入30％h2o2氧化中间产物查尔酮，得到中间体3-羟基黄酮2；

步骤三：常温下，将3-羟基黄酮、edci、dmap与皮考林酸溶于二氯甲烷，发生缩合反应，经柱层析纯化分离得到二价铜离子荧光探针3。

其制备路线如下所示：

具体地，所述二价铜离子荧光探针的制备方法包括以下步骤：

步骤一：常温下，将2’-羟基苯乙酮和4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛溶于乙醇，所述2’-羟基苯乙酮和4-(n,n-二乙基)氨基苯甲醛的物质的量比为1：1.2～2，以10％naoh为催化剂，室温反应24小时后，加入稀盐酸调整ph＝3-4，过滤并洗涤沉淀，用无水乙醇重结晶，得到中间体查尔酮1；

步骤二：取中间体查尔酮0.3g，8ml20％氢氧化钠溶液溶于20ml甲醇，将混合液置于冰水中搅拌，取6ml30％过氧化氢逐滴加入混合液中，反应3h，将反应液完全旋干后，加水，过滤，用水多次洗涤，得黄色沉淀3-羟基黄酮醇2。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.16(s,1h),8.09(t,j＝9.5hz,2h),7.79–7.67(m,2h),7.43(t,j＝7.2hz,1h),6.80(d,j＝9.2hz,2h),3.42(q,j＝7.0hz,4h),1.13(t,j＝7.0hz,6h)；

步骤三：取edci285mg，dmap60mg，皮考林酸180mg和3-羟基黄酮醇2309mg溶于25ml二氯甲烷，室温搅5h，后用饱和食盐水洗涤有机相2-3次，将有机相旋干，利用无水乙醇常温重结晶得黄色产物3。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.88(d,j＝4.1hz,1h),8.29(d,j＝7.8hz,1h),8.12(td,j＝7.8,1.7hz,1h),8.07(dd,j＝7.9,1.4hz,1h),7.94(d,j＝9.2hz,2h),7.87(td,j＝7.7,7.1,1.4hz,1h),7.83–7.76(m,2h),7.53(t,j＝7.3hz,1h),6.76(d,j＝9.2hz,2h),3.39(q,j＝8.2,7.6hz,4h),1.08(t,j＝7.0hz,6h).¹³cnmr(101mhz,dmso)δ170.11,162.10,156.07,154.80,150.37,149.77,146.15,137.98,134.26,131.12,129.78,128.32,125.95,125.41,124.96,122.72,118.40,114.17,110.97,43.72,12.34.

实施例2

参看图1，荧光探针检测二价铜离子的荧光强度随时间的变化

取1.25mgcuso4溶于蒸馏水中配置成0.5mmcuso4储备液，放入4℃环境中备用；配置磷酸缓冲盐溶液(pbs，ph＝7.4)，加入2mmctab，得到测试溶液体系pbs(2mmctab，ph＝7.4)；用dmso溶解探针分子，配成0.5mm的探针储备液，放置于冰箱冷藏室备用。

准确量取一定量的探针分子储备液，用测试溶液dmso/pbs(2mmctab,ph＝7.4，v/v＝3/7)稀释至20μm，准确量取一定量的cuso4储备液，用蒸馏水稀释至20μm。取同体积的探针溶液与cuso4溶液充分混合，工作浓度均10μm。在25℃下，每隔一段时间，在480nm激发波长下，检测反应液的荧光信号强度。由图1可见，在反应7min时，反应液在535nm处的荧光强度增强近10倍，并基本达到饱和，这表明本发明荧光探针分子能在短时间内快速检测cu²⁺。

实施例3

参看图2，荧光探针与不同浓度的二价铜离子反应的荧光反射光谱

准确量取实施例2中的探针分子储备液，用测试溶液dmso/pbs(2mmctab,ph＝7.4，v/v＝3/7)稀释后，与不同浓度的cuso4溶液(5–50μm)充分混合，工作终浓度为10μm，在25℃下反应12min，在480nm激发波长下，检测反应液的荧光信号强度。由图2可见，荧光探针与不同浓度的cu²⁺反应后，荧光在535nm处大大增强，且荧光强度随着cu²⁺浓度的升高而增强。因此，本发明荧光探针可应用于作为定性或定量检测试剂。

实施例4

参看图3，荧光探针对二价铜离子子在白光、紫外365nm条件下的可视化检测图。

准确量取实施例2中的探针分子储备液，用测试溶液dmso/pbs(2mmctab,ph＝7.4，v/v＝3/7)稀释后，与cuso4溶液充分混合反应(工作终浓度均为10μm)，分别放置在白光、紫外365nm条件观察。由图3可见，在日光条件下，与cu²⁺反应后，检测液由无色变成黄色；在紫外365nm下，与cu²⁺反应后，检测液由浅蓝色变成明亮的黄绿色。因此，本发明荧光探针可应用于目视定性检测试剂。

实施例5

参看图4，荧光探针与常见离子反应后的荧光强度及可视化检测图。

准确量取实施例2中的探针分子储备液，用测试溶液dmso/pbs(2mmctab,ph＝7.4，v/v＝3/7)稀释后，与常见的不同离子溶液(cu²⁺,na⁺,ni2⁺,sb3⁺,zn²⁺,mn²⁺,mg²⁺,al³⁺,pb²⁺,sn²⁺,k⁺,co2^+,no3^-,i^-,h2po4^-,cl^-,so4^2-,s2o3^2-,hpo4^2-,hco^3-,hs^-)充分混合反应(工作终浓度均为10μm)12min后，在480nm激发波长下，检测反应液的荧光信号强度，并分别放置在白光、紫外365nm条件观察。由图4可见，荧光探针对cu²⁺表现好良好的选择性。

实施例6

参看图5，荧光探针对细胞外源性二价铜离子的荧光成像。

将人肺癌a549细胞培养在24孔培养板中。其中，空白组细胞加入终浓度为20μm荧光探针，在37℃下孵育30min，而阳性组细胞预先加入50μmcuso4溶液孵育30min后，再加入20μm荧光探针在37℃下孵育30min，然后分别用荧光显微镜进行荧光成像检测。如图5所示，其中(a-b)为未加cuso4溶液孵育，(c-d)为加cuso4溶液孵育。由图5可见，所述荧光探针在细胞水平也能很好地检测cu²⁺。

综上所述，本发明公开了一种黄酮化合物作为二价铜离子荧光探针、制备方法及其用途。该探针可经由简单化学原料制备，合成条件温和，产品纯化处理简单，容易操作。该荧光探针识别和结合cu²⁺，在cu²⁺的作用下，探针分子发生水解，生成有强烈荧光的水解产物，并且荧光强度高低与cu²⁺含量成正比。研究实验结果显示，该荧光探针可对二价铜离子进行快速检测，选择性好，抗其他金属离子干扰能力强，可广泛应用于水溶液中二价铜离子含量的检测，目视定性检测以及在生物细胞内二价铜离子的成像检测。以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。