本发明涉及一种新的化合物及其制备方法、药物组合物和应用。具体地，本发明涉及一种具有更高的蛋白激酶g(pkg)抑制活性的新化合物jk-03m或其药学上可接受的盐及其制备方法、应用以及包含所述新化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。此新化合物或其药学上可接受的盐用于治疗疼痛、尤其是用于治疗慢性疼痛。
背景技术：
：疼痛是中枢和外周两大神经系统沟通交流的结果。虽然中枢和外周这两大神经系统共同作用产生人们的主观体验，但它们的生理结构和功能不同。撞击特定疼痛受体产生的疼痛刺激沿着居于背根神经节(外周神经系统部分)的初级伤害性感觉神经元传播，然后进入脊髓(中枢神经系统部分)传播，在脊髓将信号转发到二阶神经元，传播到脊髓的对侧，最后将信号传播到脑的更高级中枢，在那里感知为疼痛。对机械、热和化学刺激产生反应的外周疼痛受体位于初级伤害性感觉神经元的神经末梢上。这些受体的激活可产生急性或慢性疼痛。急性疼痛趋于剧烈、不扩散，通常沿δ感觉神经元的薄髓鞘的轴突传播。慢性疼痛通常钝化、扩散，沿c-型伤害性感觉神经元的非髓鞘轴突传播。在疼痛通路的不同阶段，疼痛感知可能会改变。例如，给外周受体使用局部麻醉药可消除疼痛刺激。众说周知，如类罂粟碱的药物在疼痛通路的中枢神经系统阶段起阻碍作用，而非甾体抗炎药在外周神经系统阶段起阻碍作用。非原发性脊髓损伤的慢性疼痛感知通常不仅与外周疼痛受体敏化有关，还跟二阶神经元的兴奋性改变有关，具有外周和中枢神经系统两种组件。外周和中枢两种组件分别调节“初级”和“次级”疼敏。在次级疼敏中，中枢神经系统中的二阶神经元基因表达改变，引起“中枢致敏”或“脊髓疼敏”现象。脊髓的n-甲基-d-天冬氨酸(“nmda”)受体在此过程中起了重要作用。无外周神经系统活化的脊髓损伤也能产生脊髓疼敏，导致中枢疼痛综合征。中枢神经性疼痛与creb转录因子的磷酸化有关。慢性疼痛始于外周，由神经损伤(“神经性疼痛”)或感染引起，两种原因导致的疼痛是抵制有效治疗的主要临床问题。在人和哺乳动物模型中，神经损伤后的持续疼痛与初级感觉神经元的长期过度兴奋(lth)有关，这些初级感觉神经元的轴突位于受损神经节上。由于对受损部位的疼痛感觉神经元细胞体和轴突电刺激敏化的不断增加，长期过度兴奋呈现出来。这些变化导致在静止或无伤害刺激时从感觉神经元中释放动作电位，引起中枢神经系统的高阶神经元持续激发、脊柱疼敏和持续疼痛。美国专利文献us6476007直指中枢神经系统炎性疼敏的机理，没有考虑外周神经系统的作用。瞄准中枢神经系统的疼痛通路具有许多重大弊端。首先，脊髓中的神经元回路非常复杂，据此预测缓解疼痛的药物可能具有相反的效果。其次，血脑屏障将中枢神经系统的神经元与身体其它部分隔离，这是通常阻止大量治疗药物达到靶点的巨大障碍。第三，穿透血脑屏障的药物进入整个中枢神经系统，导致严重的毒副作用。而外周神经系统就没有这些障碍，背根神经节(drg)的结构特性显示，可直指初级感觉神经元的特定种群进行治疗。第四，只有当来自外周的信号传至脑的高级中枢才能感知到疼痛，而背根神经节(drg)的神经元是这些信号的入口。活性pkg在疼痛抑制中起决定作用(见wo2006/102267)。外周神经系统受到损伤后，一氧化氮合酶(“nos”)活性增加，导致一氧化氮(“no”)产量增多。no活化可溶性鸟苷环化酶(“sgc”)，从而增加环磷酸鸟苷(“cgmp”)水平，导致在c-型和a-δ型痛觉神经元的轴突中蛋白激酶g(“pkg”)活化。活性pkg然后从损伤位点沿轴突反向传播至神经元细胞体，丝裂原活化蛋白激酶-erk(“mapkerk”)。然后，活性mapkerk转移入细胞核，调整疼痛相关基因的表达，这些基因调节lth的出现。因此抑制pkg可缓解疼痛，减少涉及伤害感受蛋白质的mrna(信使rna)水平。因此，本领域需要能够选择性抑制外周神经系统中pkg活性的化合物。对活性酶的抑制不仅可阻止它从外周神经系统传播，还可阻断它在细胞体内的活性。美国专利申请us2008/0176920述及抑制pkg活化形式的化合物，以及它们在缓解疼痛，特别是慢性疼痛综合征中的应用。在该专利申请中提到的活性较高的化合物为化合物46。本发明申请人曾按照美国专利申请us2008/0176920的方法制备出了化合物46及其类似物jk-02a，并进行了药物活性研究，研究结果显示该类化合物水溶性不够好、pkg抑制活性不够高。鉴于美国专利申请us2008/0176920中设计的化合物46水溶性较差、pkg抑制活性不够高，本发明申请人在中国专利申请cn201310540726.x中对化合物46进行结构改造，添加了水溶性较高的低分子聚乙二醇片段，从而使其水溶性明显增加、镇痛效果显著提高，尤其考察了化合物jk-02h对弗氏完全佐剂(cfa)催生的大鼠痛觉过敏的疗效研究，结果表明，化合物jk-02h在高剂量(20mg/kg)和低剂量(5mg/kg)时与溶媒组比较，均显示出明显的抗痛觉过敏疗效。然而，cn201310540726.x中化合物在镇痛过程中的毒副作用不明晰。技术实现要素：鉴于中国专利申请cn201310540726.x中通式ii所示的化合物在镇痛过程中的毒副作用不明晰，本发明对通式ii的化合物进行了进一步筛选和优化，令人惊奇的是，我们发现一种新的化合物，并对化合物及其药学可接受的盐进行考察，发现本发明化合物不仅显示出明显优于现有化合物的镇痛作用，此外，相比于jk-02h，式ⅰ的化合物药学上可接受的盐酸盐jk-03m-a对于pkg(镇痛相关)具有更好地选择性，且通过毒理学试验评价jk-03m-a的致癌、致突变风险及引发心脏毒性及其它全身毒性的风险，发现jk-03m-a在全部毒理学实验中均为阴性。因此，一方面，本发明提供了一种结构如式ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐：该化合物对蛋白激酶g具有更高的抑制活性，且具有更好地镇痛选择性和更佳的安全性。进一步的，该化合物在具备更高的抑制活性的同时，具有极低的致癌、致突变风险及引发心脏毒性及其它全身毒性的风险。另一方面，本发明提供了式ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗疼痛的药物中的应用。另一方面，本发明还提供了一种包括式ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。再一方面，本发明提供了一种制备式ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐的方法。以上被描述的和其他的特征通过下面的详细描述更加清楚。附图说明图1各测试物口服给药在小鼠醋酸扭体模型的扭体次数图2本发明化合物jk-03m-a对mor阿片受体的亲和(激动&拮抗)实验结果图3本发明化合物jk-03m-a对kor阿片受体的亲和(激动&拮抗)实验结果图4本发明化合物jk-03m-a对dor阿片受体的亲和(激动&拮抗)实验结果具体实施方式本申请的发明人发现，将中国专利申请cn201310540726.x所公开的通式ii的化合物进行进一步筛选和优化后，令人惊奇的是，我们发现一种新的化合物jk-03m，并对化合物jk-03m药学可接受的盐(以化合物jk-03m-a(jk-03m盐酸盐)、jk-03m-c(jk-03m甲磺酸盐)、jk-03m-djk-03m草酸盐、jk03m-e为例jk-03m柠檬酸盐)进行考察，发现本发明化合物不仅显示出明显优于化合物jk-02a和jk-02h的镇痛作用，此外，相比于jk-02h，jk-03m-a对于pkg(镇痛相关)具有更好地选择性，且通过毒理学试验评价jk-03m-a的致癌、致突变风险及引发心脏毒性及其它全身毒性的风险，发现jk-03m-a在全部毒理学实验中均为阴性。因此，本发明提供了用于治疗疼痛的具有更高pkg抑制活性的通式ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，该优选化合物药学上可接受的盐在小鼠醋酸扭体模型的镇痛作用研究中，相同剂量及给药途径下，本发明化合物的镇痛作用更明显，尤其是jk-03m-a药效明显好于相同剂量的布洛芬，其它两受试物，jk-02a和jk-02h的镇痛活性与布洛芬相近；在受体亲和力实验中，jk-03m-a对pkg的选择性好于jk-02h；在毒理学实验中，考察了jk-03m-a的致癌、致突变风险及引发心脏毒性及其它全身毒性的风险，发现jk-03m-a在全部毒理学实验中均为阴性。本发明的另一方面提供了式ⅰ化合物或其药学上可接受的盐在治疗疼痛中的用途。本发明的新化合物可用于治疗各种疼痛，例如慢性疼痛、神经性疼痛、急性疼痛、癌痛、类风湿性关节性疼痛、偏头痛、内脏痛等。但所列未能尽述。本发明的新化合物可用作在全身麻醉和监控麻醉护理时使用的止痛药物。常常联合使用不同性质的药物，以达到维持麻醉状态(例如记忆缺失、痛觉缺失、肌肉松弛和镇静)所需的平衡作用。联合用药包括吸入麻醉剂、安眠药、抗焦虑药、神经肌肉阻滞剂和阿片样物质。在化合物足够碱性以形成酸盐的情况下，可以以盐的形式使用所述化合物。本发明中药学上可接受的盐通常是指当以适当的方式用于治疗、应用或使用，尤其是用于人体和/或哺乳动物时，生理学相容的任意盐(通常是指无毒的)。进一步的，药学上可接受的盐是与生理学上可接受的有机酸加成盐，如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、乙磺酸盐、羟基乙酸盐、丙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、富马酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐、以及α-甘油磷酸盐等，还可与生理学上可接受的无机酸加成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、以及碳酸盐等。药学上可接受的酸加成盐可以从无机酸和有机酸制备。从无机酸获得的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。从有机酸获得的盐包括乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。在本发明一具体实施方式中，本发明式ⅰ化合物的药学上可接受的盐为化合物jk-03m的盐酸盐(jk-03m-a)，具有如下式iii所示的结构。在本发明一具体实施方式中，本发明式ⅰ化合物的药学上可接受的盐为化合物jk-03m的甲磺酸盐(jk-03m-c)，具有如下式iv所示的结构。在本发明一具体实施方式中，本发明式ⅰ化合物的药学上可接受的盐为化合物jk-03m草酸盐(jk-03m-d)，具有如下式v所示的结构。在本发明一具体实施方式中，本发明式ⅰ化合物的药学上可接受的盐为化合物jk-03m柠檬酸盐(jk-03m-e)，具有如下式vi所示的结构。在本发明一优选的实施方式中，本发明式ⅰ化合物的药学上可接受的盐为化合物jk-03m的盐酸盐(jk-03m-a)。本发明化合物可以以不同的剂量和不同的时间来施用，这取决于如受试者的健康、年龄、体重和性别等情况。本发明的另一方面提供了药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的式ⅰ化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。所述载体应被所给药的个体耐受且能将化合物递送至受侵害区域。本专利描述的药物组合物的制剂可通过药学领域已知的任何方法来制备。通常此制备方法包括下述步骤：将活性成分与载体或一种或多种其它助剂组合，如有必要，可将产品包装成希望的单剂量或多剂量单元。除活性成分之外，药物组合物可进一步包括一种或多种其它的药物活性物质，或该药物组合物可以与一种或多种其它的药学活性物质同时或相继使用。药物组合物可以以无菌可注射的水性或油性悬浮液或溶液的形式制备、包装或销售。此悬浮液或溶液可根据已知技术配制，可包括除活性成分之外的其它成分，如分散剂、润湿剂或悬浮剂等。此无菌可注射的制剂可使用无毒的稀释剂或溶液(如水或1,3-丁二醇)来制备。其它可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、单甘油酯或二甘油酯等。药物组合物的控制释放或持续释放制剂可使用常规技术来制备。活性成分的控制释放可由各种诱导因素如ph、温度、酶、水或其它生理条件或化合物来刺激。包含本发明化合物的适宜药物组合物可以通过常规的方式给药，例如口服、局部给药、非胃肠道途径给药、口腔给药、鼻腔给药、阴道给药或直肠给药或通过吸入给药。为此，本发明的化合物可以通过现有技术中已知的方法被制备成各种形式，例如片剂、胶囊剂、水溶液或油溶液、混悬液、乳液、霜剂、软膏剂、凝胶、鼻腔喷雾剂、栓剂、很细的粉末剂或吸入用气雾剂，对于非胃肠道途径给药而言(包括静脉内给药、肌肉给药或输液)，可以使用灭菌水或油溶液或混悬液或灭菌乳剂。本发明的另一方面提供一种治疗疼痛的方法，该方法包括给予改善疼痛有效量的根据式i的任何化合物或其药学上可接受的盐，或包含改善疼痛有效量的根据式i的任何化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体的药物组合物。使用本发明的化合物或其药学上可接受的盐的治疗方法，可以包括哺乳动物疼痛的预防治疗，所述哺乳动物可以为人类。本发明的另一方面提供了通式ⅰ化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)化合物1与化合物2在碱的存在下发生亲核取代反应，得到化合物3，所用的亲核取代反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自由乙腈、丙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺、1,3二甲基-2-咪唑啉酮(dmi)、二甲基亚砜(dmso)、六甲基磷酰三胺(hmpa)、四氢呋喃、二氧六环、丙酮、甲苯、二甲苯、乙醚、丙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正己烷、环己烷、甲基环己烷和正庚烷，及任意比例的组合组成的组；所述碱选自由碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸钙、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钙、氢化钠、氢化钾、氢化钙、金属钠、金属钾、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、丁基锂、苯基锂、二异丙氨基锂(lda)、六甲基二硅胺基锂(lihmds)、二甲胺、二乙胺、三乙胺、二异丙基乙胺、哌啶、吡啶、1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(dbn)、四丁基氢氧化铵及其组合组成的组；(2)所述化合物3在碱的存在下进行水解反应，得到化合物4，其中，所述水解反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自由水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、四氢呋喃、乙腈、丙腈、二甲基甲酰胺(dmf)、二甲基乙酰胺、1,3二甲基-2-咪唑啉酮(dmi)、二甲基亚砜(dmso)、六甲基磷酰三胺(hmpa)、四氢呋喃、二氧六环和丙酮，及任意比例的组合组成的组；所述碱选自由氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化铜、三氯化铝、三氯化硼、三溴化铝、三溴化硼、氰化钠、氰化钾、碳酸铯、碳酸铜、碘化锂、硼氢化钠、氢化钠、氢化钾、氢化钙及其组合组成的组；(3)所述化合物4与化合物5在缩合剂的存在下发生酰胺化反应，得到化合物6其中，所述酰胺化反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自由甲苯、二甲苯、氯苯、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、丙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正己烷、环己烷、甲基环己烷和正庚烷，及任意比例的组合组成的组；所述缩合剂选自由n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)、1-羟基苯并三氮唑(hobt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、双(2-氧代’-3-噁唑烷基)次磷酰氯(bop-cl)、1h-苯并三唑-1-氧基三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐(pybop)、1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n'-羰基二咪唑(cdi)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edc)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)、4-二甲氨基吡啶(dmap)及其组合组成的组；(4)所述化合物6与化合物7在缩合剂的存在下发生酰胺化反应，得到化合物8其中，所述酰胺化反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自由甲苯、二甲苯、氯苯、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、丙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正己烷、环己烷、甲基环己烷和正庚烷，及任意比例的组合组成的组；所述缩合剂选自由n-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(hoat)、1-羟基苯并三氮唑(hobt)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hatu)、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)、双(2-氧代’-3-噁唑烷基)次磷酰氯(bop-cl)、1h-苯并三唑-1-氧基三(1-吡咯烷基)膦六氟磷酸盐(pybop)、1,3-二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n'-羰基二咪唑(cdi)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(edc)、n,n'-二异丙基碳二亚胺(dic)、4-二甲氨基吡啶(dmap)及其组合组成的组；(5)所述化合物8在脱保护试剂的存在下进行脱保护反应，得到式i的化合物，其中，所述脱保护反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自由甲苯、二甲苯、氯苯、乙腈、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、乙醚、丙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、正己烷、环己烷、甲基环己烷和正庚烷，及其任意比例的组合组成的组；所述脱保护试剂选自由三氟乙酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、草酸、柠檬酸、对甲苯磺酸、乙酰氯、三氯化铝以及三氟化硼组成的组；其中，boc代表叔丁氧羰基保护基。定义当在此使用时，术语“有效量”表示足以产生所需效应的量。当在此使用时，术语“抑制”是指化合物减少或阻止所描述功能的能力。通常中间体没有完全进行结构确证，通常用质谱(ms)或核磁(nmr)分析评估其纯度。当使用时以下缩写和定义具体如下含义：cdcl3为氘代氯仿dcm为二氯甲烷dmf为n,n-二甲基甲酰胺hatu为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯dipea为n,n-二异丙基乙胺dmso为二甲基亚砜nmr为核磁共振现在参考下述的实施例描述本发明。提供这些实施例仅为举例说明，绝不是限制本发明。实施例中所用的4-[(2,3-二氟-6-羟基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯、(3r,4r)-n-叔丁氧羰基基-3,4-二氨基吡咯烷、1h-吲唑-6-羧酸购自河北桑迪亚医药技术有限责任公司，五甘醇单甲醚购自嘉兴博美生物技术有限公司，其余试剂均购自国药集团化学试剂北京有限公司。实施例1：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷盐酸盐(jk-03m-a)的制备步骤a：制备4-[(2,3-二氟-6-羟基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯(jk-03m-01)根据中国专利申请cn201310540726.x制备4-[(2,3-二氟-6-羟基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯，具体步骤包括：4-[(2,3-二氟-6-甲氧基苯基)羟甲基]苯甲酸甲酯向冷却至-78℃的3,4-二氟苯甲醚(20.0g,0.139mol)的无水四氢呋喃(500ml)溶液中加入2.5m的正丁基锂(61.6ml,0.154mol)，继续搅拌2h，加入对甲酰基苯甲酸甲酯(25.2g,0.154mol)的无水四氢呋喃(500ml)溶液，反应混合物在10h内缓慢升至室温。加入蒸馏水(1.0l)淬灭反应，用乙酸乙酯(3×1.0l)提取，混合有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离得淡黄色固体状中间体(1a)29.4g，收率68.6％。mass(esi+)m/z＝165(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):3.78(s,3h),3.88(s,3h),4.30(d,1h),6.36(d,1h),6.71(d,1h),7.23(d,1h),7.37(d,2h),7.94(d,2h)。4-[(2,3-二氟-6-甲氧基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯在室温氮气保护下向氯铬酸吡啶(pcc,26.2g,121.7mmol)的二氯甲烷(500ml)溶液中加入中间体(1a)(25g，81.1mmol)的二氯甲烷(250ml)溶液，反应混合物继续在室温下搅拌4h。过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离得淡黄色固体状中间体(2a)20.8g，收率83.7％。mass(esi+)m/z＝309(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):3.69(s,3h),3.94(s,3h),6.95(d,1h),7.35(d,1h),7.82(d,2h),8.09(d,2h)。4-[(2,3-二氟-6-羟基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯在-78℃下向中间体(2a)(15g,49.0mmol)的二氯甲烷(500ml)溶液中加入三溴化硼(24.5g,97.8mmol)，混合物搅拌2h，加入蒸馏水(250ml)，分液，水层用二氯甲烷(2×250ml)提取，混合有机层用饱和食盐水(500ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离得淡黄色固体状中间体(3a)13.6g，收率95.0％。mass(esi+)m/z＝307(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):3.99(s,3h),6.89(d,1h),7.26(d,1h),7.74(d,2h),8.18(d,2h),11.29(s,1h)。步骤b：制备三甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(jk-03m-02)根据文献newjournalofchemistry,2012,36(2):371-379制备三甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯，收率90％。1hnmr(300mhz,cdcl3):δ7.80(d,2h),7.35(d,2h),4.16(t,2h),3.70-3.53(m,10h),3.37(s,3h),2.45(s,3h)。步骤c：制备4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基苯甲酸甲酯(jk-03m-03)将4-[(2,3-二氟-6-羟基)苯甲酰基]苯甲酸甲酯(jk-03m-01)(43.0g,147.1mmol)、五甘醇单甲醚对甲苯磺酸酯(jk-03m-02)(120.0g,294.2mmol)、k2co3(60.9g,441.3mmol)和ki(2.44g,14.7mmol)溶于dmf(500ml)中，搅拌加热至90℃并保温反应过夜。冷却至室温，加入1n盐酸水溶液(2l)，用乙酸乙酯(500ml×2)提取，混合有机层用饱和食盐水(500ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得浅黄色固体(jk-03m-03)63.0g，收率80％。1hnmr(300mhz,dmso):δ8.12(d,2h),7.92(d,2h),7.64(d,1h),7.09(d,1h),4.09(t,2h),3.91(s,3h),3.51-3.23(m,13h)。步骤d：制备4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基苯甲酸(jk-03m-04)将4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基苯甲酸甲酯(jk-03m-03)(53.0g,100.7mmol)溶于四氢呋喃(300ml)中，加入2nlioh水溶液(100ml,201.3mmol)，反应液在室温搅拌过夜。减压蒸除四氢呋喃，残留物加蒸馏水(400ml)稀释，水相用乙酸乙酯(200ml×2)洗涤两次，然后用4nhcl酸化至ph3～4，加二氯甲烷(200ml×3)提取，合并二氯甲烷提取液，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得浅黄色油状物(jk-03m-04)45.0g，收率87％。1hnmr(300mhz,dmso):δ8.10(d,2h),7.90(d,2h),7.63(d,1h),7.09(d,1h),4.09(t,2h),3.50-3.23(m,13h)。步骤e：制备(3r,4r)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二氨基吡咯烷(jk-03m-05)根据中国专利申请cn201310540726.x制备(3r,4r)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二氨基吡咯烷，具体步骤包括：(3r,4r)-1-n-苄基-3,4-二羟基吡咯烷-2,6-二酮向l-(+)-酒石酸(150.1g,1.0mol)的50％甲醇水溶液(200ml)中缓慢加入苄胺(107.2g,1.0mol)。反应混合物在50℃加热搅拌至澄清，减压浓缩。向残留物中加入二甲苯(3l)，反应混合物在油浴中回流分水8h。冷却后减压浓缩，用无水乙醇(2×150ml)带去痕量的二甲苯。向残留物中加入无水乙醇(700ml)，搅拌加热至回流，并回流保温30min。冷却至室温，过滤，滤饼用无水乙醇(3×100ml)洗涤，干燥得白色针状中间体((3r,4r)-4)153.9g，收率69.6％。合并滤液和洗液，浓缩至300ml，加入活性炭(30g)，回流搅拌30min，趁热过滤，滤饼用热乙醇(100ml)洗涤。合并滤液和洗液，静止冷却结晶，过滤，又得到中间体((3r,4r)-4)33.4g(15.1％)。两次共得到中间体((3r,4r)-4)187.3g，合计收率为84.7％。mass(esi+)m/z＝222(m+h)+。1hnmr(400mhz,dso-d6):4.38(d,2h),4.53(d,1h),4.58(d,1h),6.29(d,2h),7.24(m,2h),7.27(m,1h),7.33(m,2h)。(3s,4s)-1-n-苄基-3,4-二羟基吡咯烷在氮气保护下，向冷却至0℃后的lialh4(61.2g,1.6mol)的四氢呋喃(3.6l)溶液中慢慢加入中间体((3r,4r)-4)(132.7g,0.6mol)。反应混合物回流12h，冷却至室温，在冰水浴中滴加乙酸乙酯(144ml)。剧烈搅拌下依次滴入蒸馏水(61.2ml)、5％naoh(61.2ml)和蒸馏水(183.6ml)。过滤，滤饼用热四氢呋喃(2×1.2l)洗涤。合并滤液和洗液，减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得浅黄色油状物，经乙酸乙酯重结晶后得白色固体状中间体((3s,4s)-5)82.3g，收率71.0％。mass(esi+)m/z＝194(m+h)+。1hnmr(400mhz,dso-d6):2.30(dd,2h),2.74(dd,2h),3.46(d,1h),3.57(d,1h),3.84(m,2h),4.84(brs,2h),7.20-7.35(m,5h)。(3s,4s)-3,4-二羟基吡咯烷将中间体((3s,4s)-5)(77.3g,0.4mol)溶于80％的乙醇水溶液(2.4l)中，加入10％pd/c(7.0g)，室温通氢(0.07mpa)反应2d。过滤除去催化剂，滤液减压浓缩，残留物用无水乙醇(2×250ml)带除痕量水分得黄色油状中间体((3s,4s)-6)37.5g，收率90.9％。mass(esi+)m/z＝104(m+h)+。1hnmr(400mhz,dso-d6):2.60(m,2h),3.02(m,2h),3.83(m,2h),4.81(brs,3h)。(3s,4s)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二羟基吡咯烷剧烈搅拌下，向中间体((3s,4s)-6)(30.9g,0.30mol)和碳酸氢钠(218.9g,25.8mol)的50％二氧六环水溶液中滴加二碳酸二叔丁酯(98.2g,0.45mol)。反应混合物在室温下搅拌2h，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得白色固体状中间体((3s,4s)-7)51.6g，收率84.6％。mass(esi+)m/z＝204(m+h)+。1hnmr(400mhz,dso-d6):1.39(s,9h),3.11(dd,2h),3.34(dd,2h),3.86(m,2h),5.06(d,2h)。(3s,4s)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二甲基磺酰氧基吡咯烷向冷却至0℃后的中间体((3s,4s)-7)(50.8g,0.25mol)的二氯甲烷(1.6l)溶液中加入三乙胺(140ml,1.0mol)和甲基磺酰氯(58ml,0.75mol)。去除冰盐浴后，反应混合物自然升至室温，在室温继续搅拌6h。反应混合物依次用饱和氯化铵和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得白色固体状中间体((3s,4s)-8)84.7g，收率94.3％。mass(esi+)m/z＝360(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):1.47(s,9h),3.12(s,6h),3.71(m,2h),3.79(d,1h),3.82(d,1h),5.19(brs,2h)。(3r,4r)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二叠氮基吡咯烷向中间体((3s,4s)-8)(71.9g,0.20mol)的dmf(1.8l)溶液中加入nan3(143.0g,2.2mol)。反应混合物在90℃下加热24h，减压蒸干，残留物用乙酸乙酯(900ml)稀释，用蒸馏水(3×180ml)洗涤。水层用乙酸乙酯(180ml)提取，混合有机层用饱和食盐水(90ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得黄色油状中间体((3r,4r)-9)34.4g，收率67.9％。mass(esi+)m/z＝254(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):1.45(s,9h),3.34(m,2h),3.65(m,2h),3.94(m,2h)。(3r,4r)-1-n-叔丁氧羰基-3,4-二氨基吡咯烷将中间体((3r,4r)-9)(30.4g,0.12mol)溶于无水甲醇(500ml)中，加入10％pd/c(12.8g，12mmol)，室温通氢(0.1mpa)反应18h。过滤除去催化剂，滤液减压浓缩得黄色油状中间体((3r,4r)-10)23.4g，收率96.9％。mass(esi+)m/z＝202(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):1.48(s,9h),1.64-1.99(m,4h),3.14-3.37(m,2h),3.38-3.52(m,2h),3.52-3.78(m,2h)。步骤f：制备(3r,4r)-3-氨基-4-{4-[2,3-二氟-6-(3,6,9,12,15-五氧杂戊烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(jk-03m-06)向冷却至0℃的4-[2,3-二氟-6-(3,6,9,12,15-五氧杂戊烷-1-氧基)]苯甲酰基苯甲酸(jk-03m-04)(76.0g,148.3mmol)、(3r,4r)-n-叔丁氧羰基基-3,4-二氨基吡咯烷(jk-03m-05)(53.7g,267.0mmol)的dmf(700ml)溶液中加入hatu(62.0g,163.2mmol),滴加dipea(38.4g,296.7mmol)约20分钟，反应混合物升至室温下搅拌过夜，加入1n氯化铵水溶液(2000ml)，用乙酸乙酯(800ml×3)提取，混合有机层用饱和氯化铵水溶液(800ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得浅黄色固体(jk-03m-06)70.0g(纯度80～90％)，直接投下一步反应。mass(esi+)m/z＝696.3[m+h]+；1hnmr(300mhz,dmso):δ8.94(brd,1h),8.11(brd,2h),8.02(d,2h),7.90(d,2h),7.62(d,1h),7.09(d,1h),4.58(brd,1h),4.06(t,2h),3.73(t,3h),3.50-3.30(m,20h),3.23(s,3h),1.43(s,9h)。步骤g：制备1h-吲唑-6-羧酸(jk-03m-07)根据中国专利申请cn201310540726.x制备1h-吲唑-6-羧酸，具体步骤包括：3-氨基-4-甲基苯甲酸甲酯将3-氨基-4-甲基苯甲酸(60.5g,0.40mol)溶于无水甲醇(1.5l)中，搅拌冷却至5℃。缓慢滴加氯化亚砜(103.6g,0.87mol)，滴完后回流搅拌6h。冷却至室温，反应液减压浓缩，残留物用冰水(1.2l)稀释，加5％的nahco3中和至ph7.5。水层用乙酸乙酯(3×600ml)提取，混合有机层用饱和食盐水(2×500ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得白色固体状中间体(11)62.7g，收率94.9％。mp114-116℃1hnmr(400mhz,cdcl3):2.19(s,3h),3.73(brs,2h),3.87(s,3h),7.09(m,1h),7.34-7.37(m,2h)。1h-吲唑-6-羧酸甲酯将3-氨基-4-甲基苯甲酸甲酯(57.8g,0.35mol)溶于冰醋酸(1.5l)中，缓慢滴加nano2(24.2g,0.35mol)的蒸馏水(350ml)溶液。反应液在室温搅拌5h，减压浓缩，向残留物中加入蒸馏水(500ml)，用乙酸乙酯(3×1.0l)提取。有机层用蒸馏水(1.5l)和食盐水(1.5l)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得浅黄色固体状中间体(12)49.5g，收率80.8％。mass(esi+)m/z＝177(m+h)+。1hnmr(400mhz,cdcl3):3.96(s,3h),7.80-7.85(m,2h),8.14(s,1h),8.27(s,1h)。1h-吲唑-6-羧酸将1h-吲唑-6-羧酸甲酯(44.0g,0.25mol)溶于四氢呋喃(500ml)中，加入2nlioh水溶液(200ml,0.40mol)，反应液在50℃搅拌4h。冷却至室温，减压蒸除四氢呋喃，残留物加蒸馏水(200ml)稀释，用1nhcl酸化至ph3.5，加乙酸乙酯(3×500ml)提取，混合有机层用食盐水(500ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得浅黄色固体状中间体(13)34.7g，收率85.6％。mass(esi+)m/z＝163(m+h)+。1hnmr(400mhz,cd3od):7.79-7.87(m,2h),8.14(s,1h),8.29(s,1h)。步骤h：制备(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(jk-03m-08)向冷却至0℃的(3r,4r)-3-氨基-4-{4-[2,3-二氟-6-(3,6,9,12,15-五氧杂戊烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(jk-03m-06)(70.0g,100.7mmol)、1h-吲唑-6-羧酸(jk-03m-07)(24.5g,151.1mmol)的dmf(800ml)溶液中加入hatu(46.0g,120.8mmol)，滴加dipea(52.1g,402.8mmol)约20分钟，反应混合物升至室温下搅拌过夜，加入1n氯化铵水溶液(2000ml)，用乙酸乙酯(1000ml×3)提取，混合有机层用饱和氯化铵水溶液(1000ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，残留物经硅胶柱分离纯化得浅黄色固体(jk-03m-08)55.0g(两步总收率44％)。mass(esi+)m/z＝840.2[m+h]+；1hnmr(300mhz,dmso):δ13.36(s,1h),8.91(d,1h),8.77(d,1h),8.14(s,1h),8.03(s,2h),7.98(d,2h),7.86(m,3h),7.57(m,2h),7.08(d,1h),4.64(m,2h),4.07(m,2h),3.75(m,2h),3.48-3.20(m,15h),1.43(s,9h)。步骤i：制备(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷盐酸盐(jk-03m-a)向冷却至0℃的(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(jk-03m-08)(63.0g,75.1mmol)的乙酸乙酯(500ml)溶液中加入2n氯化氢乙酸乙酯溶液(500ml)，反应混合物在室温搅拌过夜。反应液浓缩干，加入无水乙醇(800ml)搅拌1h，过滤，滤液减压浓缩至100ml。搅拌下缓慢滴加乙酸乙酯至有絮状固体析出，停止滴加，室温继续搅拌1h，然后继续滴加乙酸乙酯，直至固体完全析出，室温继续搅拌1h，过滤，真空减压干燥得黄色固体状产品(jk-03m-a)49.0g，收率84％。mass(esi+)m/z＝740.4[m+h]+；1hnmr(300mhz,dmso):δ9.64(brd,2h),9.19(d,1h),9.01(d,1h),8.16-8.04(m,4h),7.86(m,3h),7.62(m,2h),7.08(m,1h),4.72(m,2h),4.07(m,2h),3.71(m,2h),3.48-3.21(m,15h)。实施例2：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷甲磺酸盐(jk-03m-c)的制备步骤1：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷三氟乙酸盐(jk-03m-b)的制备将(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)苯甲酰基]}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(jk-03m-08)(50.0g,59.6mmol)加到二氯甲烷:三氟乙酸(5:1)中，室温搅拌过夜，浓缩至干，残分中加入乙醚，析出沉淀，过滤，干燥得淡黄色固体产品55g。步骤2：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷甲磺酸盐(jk-03m-c)的制备将(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷三氟乙酸盐10.0g溶于水中，用碳酸钠溶液中和，二氯甲烷提取，提取液用饱和盐水洗涤后干燥，浓缩，残分用乙醇溶解，加入甲磺酸搅拌1小时，浓缩到原体积三分之一后冷却析晶，过滤，干燥得黄色固体产品7.7g。实施例3：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷草酸盐(jk-03m-d)的制备将(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(3,6,9,12,15-五氧杂戊烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷三氟乙酸盐10.0g溶于水中，用碳酸钠溶液中和，二氯甲烷提取，提取液用饱和盐水洗涤后干燥，浓缩，残分用乙醇溶解，加入草酸搅拌1小时，浓缩到原体积三分之一后冷却析晶，过滤，干燥得浅褐色固体产品7.6g。实施例4：(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷柠檬酸盐(jk-03m-e)的制备将(3r,4r)-3-{4-[2,3-二氟-6-(4,7,10-三氧杂壬烷-1-氧基)]苯甲酰基}苯甲酰氨基-4-(1h-吲唑-6-甲酰氨基)吡咯烷三氟乙酸盐10.0g溶于水中，用碳酸钠溶液中和，二氯甲烷提取，提取液用饱和盐水洗涤后干燥，浓缩，残分用乙醇溶解，加入柠檬酸搅拌1小时，浓缩到原体积三分之一后冷却析晶，过滤，干燥得淡黄色固体产品8.2g。实施例5溶解度实验实验中发现，不同化合物在水中的溶解度不尽相同，化合物jk-03m-a、jk-03m-c、jk-03m-d、jk-03m-e在水中的溶解度普遍比化合物jk-02a和jk-02h要好，结果如表1所示。表1不同化合物(各100mg)在水中溶解度结果实施例6药效学实验实验目的：验证受试品jk-03m-a、jk-03m-c、jk-03m-d、jk-03m-e、jk-02a、jk-02h口服给药在小鼠醋酸扭体模型的镇痛作用，并与相同剂量及给药途径的布洛芬进行比较。jk-03m-a、jk-03m-c、jk-03m-d、jk-03m-e的制备方法参见本发明实施例1-4，jk-02a的制备参照美国专利申请us2008/0176920，化合物jk-02h的制备参照中国专利申请cn201310540726.x。实验方法：取50只雌性昆明种小鼠，称重，随机均分5组，并进行标记，各组均为灌胃给药：阴性对照组生理盐水、阳性对照组布洛芬水溶液(200mg/kg)、jk-03m-a组(200mg/kg)、jk-03m-c组(200mg/kg)、jk-03m-d组(200mg/kg)、jk-03m-e组(200mg/kg)、jk-02a组(200mg/kg)、jk-02h组(200mg/kg)。给药60min后，每组小鼠分别腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/10g，记录15min内小鼠的扭体反应次数(腹部内凹、躯干与后腿伸张、臀部抬高)。实验结果：结果如表2及图1所示。结果表明，各给药组均有不同程度的镇痛作用，与生理盐水比较，小鼠在15分钟内的扭体次数明显下降。其中，jk-03m-a、jk-03m-c、jk-03m-d、jk-03m-e的镇痛作用相近，其中以jk-03m-a最为明显，药效明显好于相同剂量的布洛芬。其它两受试物，jk-02a和jk-02h的镇痛活性与布洛芬相近。表2：小鼠扭体次数实验组扭体次数实验组扭体次数生理盐水27±3.9jk-03m-d10±1.9布洛芬17±2.6jk-03m-e12±2.1jk-03m-a9±2.4jk-02a18±3.2jk-03m-c12±3.1jk-02h19±2.1实施例7受体亲和力实验实验目的：测试jk-03m-a及jk-02h对pkg(镇痛相关)、pka(镇痛无关)及cox-1、cox-2各酶的亲和力，同时评价了样品与3种阿片受体(μ,κ,σ)的亲和力；staurosporine(星形孢菌素，一种非选择性抑制剂，可同时抑制pka和pkg)，sc-560(cox-1的选择性抑制剂)和rofecoxib(cox-2的选择性抑制剂)作为阳性对照。拟通过以上实验，初步确定样品的镇痛机制，是否通过pkg抑制作用实现。此外，通过观察cox-1、cox-2及阿片受体的亲和力，还可对样品诱发胃肠道及心脏方面的副作用及成瘾等风险进行初步的评估。实验方法：pkg、pka及cox-1、cox-2亲和力检测采用酶学实验方法，使用envision多功能酶标仪读取化学发光，并计算相应的ic50值，结果参见表3和表4。阿片受体亲和力实验采用钙流实验方法，用flexstationii仪检测，第15秒开始由仪器自动加入25μl溶解有已知激动剂的钙缓冲液，最终读取525nm处荧光值，结果分别参见图2～4。实验结果：通过实验证明，两受试样品均对pkg具有较好的选择性，而对其它的酶或受体，则无明显的抑制或激动作用。比较而言，jk-03m对pkg的选择性好于jk-02h。表3：待测化合物对各激酶抑制ic50结果表4：待测化合物对cox-1及cox-2抑制的ic50实施例8毒理学实验实验目的：初步评价jk-03m-a致癌、致突变风险及引发心脏毒性及其它全身毒性的风险。实验方法：采用ames实验、herg实验两种体外实验方法，评价jk-03m的致癌、致突变及引发心脏毒性的风险；通过小鼠安全药理实验，观察样品单次口服给药后对小鼠神经系统是否具有影响。实验结果：实验结果见表5。通过本实验证明，jk-03m-a在全部毒理学实验中均为阴性，初步认为，样品具有较好的完全性。表5：jk-03m-a毒理学实验结果当前第1页12