三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重PCR快速检测试剂盒与方法与流程

本发明涉及一种病原菌的检测试剂盒与检测方法，特别是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒与检测方法。

背景技术：

需钠弧菌是海洋微生物中常见的兼性厌氧细菌，广泛存在于河口入海处、近海岸的海水、海底沉积物及海生动物中，是一种条件致病菌，可导致水产养殖动物患病死亡，死亡率高达87.5-100%，严重危害我国海水养殖业的健康发展。

目前鉴定弧菌的技术有：

1、经典的生理生化鉴定方法，该法繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素养；

2、细菌快速自动鉴定系统，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；

3、基于核酸的检测技术，包括dna探针和pcr技术(聚合酶链式反应技术)，相对上述检测技术而言，该技术具有快速、简捷、灵敏等特点。

但是，目前针对该需钠弧菌的研究主要停留在病原的分离和实验室鉴定，还没有一个快速检测方法报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒，实现三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速、准确检测。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了应用上述试剂盒进行三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒，其特点是，该试剂合由下列物品组成：

1)阴性对照，成份为1ml灭菌双蒸水1支;

2)阳性对照，试剂成份为溶于1ml灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1菌株dna1支；

3)含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr缓冲液1支；

4)引物对toxr-f/toxr-r

toxr-f为：5'-aatccgctttcctctgtt-3'1支；

toxr-r为：5'-ggcgttagcacaggtaca-3'1支；

5)引物对vhh-f/vhh-r

vhh-f：5'-aatgtcatccgccaacga-3'1支；

vhh-r：5'-ccgtcaggcgaatcaatg-3'1支；

6)灭菌双蒸水1支；

7)包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中；将阳性对照单独存放；试剂盒于-20°c保存。

本发明方法中所涉及的菌株需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1，已经在《三疣梭子蟹病原-需钠弧菌的分离和分子鉴定》中公开，上述公开文献发表于世界水产学会杂志（journaloftheworldaquaculturesociety），2016，47(6):854-861。

菌株需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋生命与水产学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋生命与水产学院实验室可对外发放。

本发明所述的一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒，其进一步优选的技术方案是，引物设计的设计方法如下：参照genbank上收录需钠弧菌的溶血素vhh基因序列dq663483和跨膜转录激活蛋白toxr基因序列jf930637设计两对引物。

本发明还公开了一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测方法，其特点是，利用以上技术方案所述的试剂盒进行三疣梭子蟹需钠弧菌病原双重pcr检测方法；检测前准备细菌基因组提取试剂盒；检测步骤如下：

（1）dna模板的提取：将1ml过夜培养的需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液，12,000g离心1min，尽量弃上清；加入100μllb11和20μl蛋白酶k，震荡至菌体彻底悬浮；55°c孵育20min；加入20μlrnasea混匀静置2min；加入400μlbb11涡旋30s；将全部液体加入离心柱中，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μlcb11，12,000g离心30s，弃流出液；再加入500μlcb11，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μlwb11，12000g离心30s，弃流出液；再加入500μlwb11，12,000g离心30s，弃流出液；12000g离心2min，彻底去除残留的wb11；将离心柱转移至一个新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入100μl预热的洗脱液室温静置5min，12000g离心1min，洗脱dna；再将洗脱液置于离心柱中，室温静置5min，12000g离心1min，得dna模板，-20°c保存备用；

（2）pcr预混合液的配制，分别采用以下方法：

使用前将试剂盒中需用试剂离心数秒钟后，按下列方式加入各种成分，除dna模板外的各试剂预先加入混合好后，最后加入提取的dna模板、阳性对照或阴性对照，加dna模板的区域与加入其它试剂的区域分开，总体积为25μl；

pcr预混合液加入方式:

含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr缓冲液13μl

引物对toxr-f/toxr-r各2μl

引物对vhh-f/vhh-r各1μl

灭菌双蒸水4-5μl

dna模板或阳性对照或阴性对照1-2μl

总体积：25μl

（3）将pcr预混合液装入pcr反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖；设置pcr循环参数如下，进行扩增：

95℃预变性5min后，

94℃变性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环，

最后72℃延伸10min；

（4）扩增反应结束后取加入2μl溴酚蓝与3μlpcr混合液混匀，经2%琼脂糖凝胶电泳，电压按长度5v/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观查结果:若在308bp和526bp处出现条带，则证明需钠弧菌为阳性，说明阳性对照或待测样品中携带需钠弧菌；否则为阴性，说明阴性对照或待测样品中不携带需钠弧菌。

以上所述的一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测方法，进一步优选的技术方案是，dna模板的提取过程中：过夜培养的需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液培养方法如下：取2.6g2216e固体培养基加过滤海水至100ml，调ph值为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟后倒平板；超净台内划线接种需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1，28℃培养24小时后，挑取单菌落至2ml2216e液体培养基中28℃过夜培养。

在虾蟹养殖过程中，通过采用本发明试剂盒与检测方法对养殖对象和养殖水体进行定期检测，实现海水甲壳动物需钠弧菌病原的动态监测，一经发现某一动物携带有该病原，则及时使用相应药物进行早期防治，避免病原在水产动物间的扩散传播，减少需钠弧菌病害给水生甲壳动物养殖业造成的巨大损失，从而对海水甲壳动物养殖业的健康发展起到积极有效的作用。在水产动物苗种病原检测中，本发明方法可以对需钠弧菌进行精准检测，确保所选亲本和放养的蟹/虾苗不携带需钠弧菌病原，减少养殖过程中需钠弧菌病害的发生。

与现有技术相比，本发明设计了一种快速特异的双重pcr检测试剂盒与检测方法，实现对需钠弧菌精准检测。该检测方法的优点主要体现在一下几方面：1）基于溶血素（vhh）基因和跨膜转录激活蛋白（toxr）基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行pcr检测，结果仅对需钠弧菌呈现阳性，其它弧菌和细菌都是阴性，避免16srrna-pcr检测方法假阳性的出现，具有较高的特异性；2）该检测方法具有较高的灵敏性，最低可以检测出13.2pg的需钠弧菌基因组dna。3）利用优化好的pcr体系进行检测，操作简单，不需要专门技术人员，而且全程时间很短，耗时少。

附图说明

图1为实施例4中需钠弧菌pcr特异性检测结果图。图中：m：dl2000marker，1：需钠弧菌vhh基因单一pcr结果；2：需钠弧菌toxr基因单一pcr结果；3：需钠弧菌vhh基因和toxr基因双重pcr结果；4：霍乱弧菌双重pcr结果；5：副溶血弧菌双重pcr结果；6：河口弧菌双重pcr结果；7：鳗弧菌双重pcr结果；8：嗜水气单胞菌双重pcr结果；9：哈氏弧菌双重pcr结果；10：杀鲑气单胞菌双重pcr结果；11：美人鱼弧菌双重pcr结果；12：温和气单胞菌双重pcr结果；13：创伤弧菌双重pcr结果。

图2为需钠弧菌双重pcr灵敏性检测结果图；图中：m是marker，1：132μg/ml，2：13.2μg/ml，3：1.32μg/ml，4：1.32×10^-1μg/ml，5：1.32×10^-2μg/ml,6：1.32×10^-3μg/ml,7：1.32×10^-4μg/ml,8：1.32×10^-5μg/ml,9：1.32×10^-6μg/ml。

具体实施方式

以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒，该试剂合由下列物品组成:

1)阴性对照，成份为1ml灭菌双蒸水1支;

2)阳性对照，试剂成份为溶于1ml灭菌双蒸水中100ng的需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1菌株dna1支；

3)含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr缓冲液1支；

4)引物对toxr-f/toxr-r

toxr-f为：5'-aatccgctttcctctgtt-3'1支；

toxr-r为：5'-ggcgttagcacaggtaca-3'1支；

5)引物对vhh-f/vhh-r

vhh-f：5'-aatgtcatccgccaacga-3'1支；

vhh-r：5'-ccgtcaggcgaatcaatg-3'1支；

6)灭菌双蒸水1支；

7)包装盒子，一块泡沫板，其大小与包装盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中；将阳性对照单独存放；试剂盒于-20°c保存。

实施例2，利用实施例1所述的试剂盒进行三疣梭子蟹需钠弧菌病原双重pcr检测方法；检测前准备北京全式金生物技术有限公司提供的细菌基因组提取试剂盒；检测步骤如下:

（1）dna模板的提取：将1ml过夜培养的需钠弧菌（vibrionatriegens）xa1菌液，12,000g离心1min，尽量弃上清；加入100μllb11和20ul蛋白酶k，震荡至菌体彻底悬浮；55°c孵育20min；加入20μlrnasea混匀静置2min；加入400μlbb11涡旋30s；将全部液体加入离心柱中，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μlcb11，12,000g离心30s，弃流出液；再加入500μlcb11，12,000g离心30s，弃流出液；加入500μlwb11，12000g离心30s，弃流出液；再加入500μlwb11，12,000g离心30s，弃流出液；12000g离心2min，彻底去除残留的wb11；将离心柱转移至一个新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入100μl预热的洗脱液室温静置5min，12000g离心1min，洗脱dna；再将洗脱液置于离心柱中，室温静置5min，12000g离心1min，得dna模板，-20°c保存备用；

（2）pcr预混合液的配制，分别采用以下方法：

使用前将试剂盒中需用试剂离心数秒钟后，按下列方式加入各种成分，除dna模板外的各试剂预先加入混合好后，最后加入提取的dna模板、阳性对照或阴性对照，加dna模板的区域与加入其它试剂的区域分开，总体积为25μl；

pcr预混合液加入方式:

含mg²⁺、dntp和dna聚合酶的pcr缓冲液13μl

引物对toxr-f/toxr-r各2μl

引物对vhh-f/vhh-r各1μl

灭菌双蒸水4-5μl

dna模板或阳性对照或阴性对照1-2μl

总体积：25μl

（3）将pcr预混合液装入pcr反应管，置于基因扩增仪中，如仪器无热盖，加入1-2滴石蜡油封盖；设置pcr循环参数如下，进行扩增：

95℃预变性5min后，

94℃变性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环，

最后72℃延伸10min；

（4）扩增反应结束后取加入2μl溴酚蓝与3μlpcr混合液混匀，经2%琼脂糖凝胶电泳，电压按长度5v/cm电泳30-40min后于紫外分析仪下观查结果:若在308bp和526bp处出现条带，则证明需钠弧菌为阳性，说明阳性对照或待测样品中携带需钠弧菌；否则为阴性，说明阴性对照或待测样品中不携带需钠弧菌。

实施例3，三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒及检测方法应用实验。采用实施例1的试剂盒与实施例2记载的检测方法：

实验内容:采用淮海工学院提供的引物、实验材料及实验方法，对连云港市赣榆区10个不同虾蟹养殖池塘的海水、三疣梭子蟹和对虾进行随机取样，共收集30个三疣梭子蟹、30个对虾和30个水样，然后分别用本研究的双重pcr、16srrna-pcr和体外培养等方法进行检测。

实验结果是18个梭子蟹、9个对虾和15个水样双重pcr结果是阳性，22个梭子蟹、17个对虾和20个水样16srrna-pcr结果是阳性，基于pcr结果分别对双重pcr和16srrna-pcr检测都为阳性以及双重pcr和16srrna-pcr分别为阳性的样本做弧菌体外培养，结果发现双重pcr和16srrna-pcr结果都很亮的样本能够分离到弧菌，pcr条带略弱的样本有的出现弧菌生长，有的一直不见弧菌生长，即使将培养时间延长1周。因此，利用该方法的高灵敏度，在水产甲壳动物弧菌病原检测中，双重pcr方法能检测出水产甲壳动物是否处于需钠弧菌感染的初期，而分离培养方法只能检测到感染的中后期。另一方面，利用双重pcr方法的高特异性，双重pcr法不会像16srrna-pcr方法一样造成错检，因此双重pcr检测方法更适宜于微量需钠弧菌的检测，可对海水甲壳动物弧菌感染早期和中期进行临床检测。

实施例4，三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒及检测方法研究实验：

引物设计：

参照genbank上收录需钠弧菌的溶血素（vhh）基因序列（dq663483）和跨膜转录激活蛋白（toxr）基因序列（jf930637）设计两对引物：

toxr-f：aatccgctttcctctgtt和toxr-r：ggcgttagcacaggtaca（片段大小为308bp）

vhh-f：aatgtcatccgccaacga和vhh-r：ccgtcaggcgaatcaatg（片段大小为526bp）送上海英俊生物技术有限公司合成。

需钠弧菌实验室培养

取2.6g杭州天和微生物试剂有限公司生产的2216e固体培养基加过滤海水至100ml，调ph值为7.2-7.4，121℃灭菌20分钟后倒平板。超净台内划线接种需钠弧菌，28℃培养24小时后，挑取单菌落至2ml2216e液体培养基中28℃过夜培养。

需钠弧菌基因组dna的提取

取1ml菌悬液用北京全式金生物技术有限公司提供的细菌基因组提取试剂盒提取需钠弧菌基因组dna，-20℃保存备用。

pcr体系的建立与优化

通过一系列实验，对各引物浓度、退火温度和延伸时间等反应体系和参数进行调整和优化，最终确定需钠弧菌病原双重pcr反应最佳体系为：13μl的2×mastermix（包含mg²⁺、dntp和dna聚合酶），10μmol/l引物vhh-f/vhh-r各1μl、tox-f/tox-r各2μl，基因组dna100ng、双蒸水补足到25μl。pcr反应条件为：95℃预变性5min后，94℃变性1min、53.3℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

pcr特异性检测

将对照的水产动物常见病原：霍乱弧菌（vibriocholerae）、副溶血弧菌（vibrioparahaemolyticus）、河口弧菌（vibrioaestuarianus）、鳗弧菌(vibrioanguillarum)、嗜水气单胞菌（aeromonashydrophila）、哈氏弧菌(vibrioharveyi)、杀鲑气单胞菌（aeromonassalmonicidasubsp）、美人鱼弧菌(vibriodamsela)、温和气单胞菌（aeromonassobria）和创伤弧菌（vibriovulnificus）的基因组dna分别进行pcr体系和条件优化，最后将所有pcr结果利用2%琼脂糖凝胶电泳检测，需钠弧菌单一和双重pcr以及其它细菌病原双重pcr结果见图1。由图可以看出，无论是单一pcr还是双重pcr，需钠弧菌都能扩增出目的条带，而其它细菌都没有条带，表明本实验设计的pcr引物具有很好的特异性。

pcr灵敏性检测

将原始浓度为132μg/ml的需钠弧菌dna进行10倍体系梯度稀释，利用上面优化的pcr体系和条件进行双重pcr扩增，然后利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。由图可知，溶血素（vhh）基因引物检测的灵敏度比跨膜转录激活蛋白（toxr）基因高一个数量级，既vhh基因引物对13.2pg的需钠弧菌基因组dna能扩增到条带，而toxr基因只能对132pg的需钠弧菌基因组dna扩曾到条带，但二者结合使用，既提高了检测的灵敏度，同时也增强了检测的可信度，避免假阳性的出现。