水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于农作物分子遗传育种学领域，涉及水稻抗白叶枯病基因xa5的分子标记及其应用。

背景技术：

水稻是我国最重要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全和国民经济增长具有重要意义。白叶枯病是水稻生产上最重要的细菌性病害，由于高产、不抗病品种的大范围推广导致抗源稀缺，白叶枯病在我国快速扩展蔓延，造成严重危害(章琦.水稻白叶枯病抗性的遗传及改良[m].北京：科学出版社，2007：116-118.)。进一步发掘和利用我国抗白叶枯病基因资源，采用以选育和种植抗病品种为主的综合防治技术可以有效地控制这种病害的发生。

迄今，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共38个。其中，已定位的白叶枯病抗性基因有29个，有10个白叶枯抗性基因被克隆。这些抗病基因可以引入或聚合到现代品种，选育出高抗、广谱的品种。但传统育种方法费时、费力、表型鉴定困难、育种效率低，由于抗病基因多为显性、基因间往往存在上位性互作，抗病基因聚合更为困难。通过分子标记辅助育种可以有效解决这一问题。

我国幅员辽阔，水稻种植区众多，蕴藏有丰富的稻种资源，但各稻区品种的抗性基因组成不同。从我国种质资源中鉴定抗白叶枯病基因以便能够掌握种植品种的抗病基因组成，及时增加抗病品种、丰富抗源多样性，合理布局品种，对提高我国水稻抗白叶枯病育种水平有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供水稻品种抗白叶枯病基因xa5的分子标记检测方法。通过检测抗病基因xa5及其等位基因扩增片段的酶切片段数目及大小，可以确定有无抗病基因xa5，并预测水稻植株的白叶枯病抗性，加快抗白叶枯病水稻新品种的选育进度。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记，该分子标记的上游引物xa5f如seqidno.1所示，下游引物xa5r如seqidno.2所示；扩增产物大小为164bp。

水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记引物，上游引物xa5f如seqidno.1所示，下游引物xa5r如seqidno.2所示；扩增产物大小为164bp。

本发明所述的分子标记在鉴别水稻白叶枯抗性基因xa5中的应用。

本发明所述的分子标记引物在鉴别水稻白叶枯抗性基因xa5中的应用。

本发明所述的分子标记引物在鉴别抗白叶枯病水稻中的应用。

水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记检测方法，包括如下步骤：

(1)取水稻样品，提取水稻样品基因组dna；

(2)利用表1中的分子标记引物，对所述的水稻样品基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，扩增出164bp的目标条带后进行xhoi限制性内切酶的检测，只有在切出143和21bp两条带的情况下才能说明品种含有纯合隐性xa5基因(表2)；

表1pcr扩增的引物

表2酶切结果的情况分析

所述的方法分两步实验进行检测，第一步pcr反应：pcr扩增的反应体系为：体积为50μl，其中10×含mg²⁺的缓冲液5.0μl，4pmol/μl的表1中所述的分子标记引物对2.0μl，10mmdntpmix1.0μl，1u/μldnapolymerase1.0μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板dna1.0μl，加水至50μl；反应程序为：dna95℃预变性3分钟后；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸展30秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。在biometre扩增仪上进行pcr扩增，取6μl扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离检测，如果扩增出对应大小的分子标记dna片段，标志着xa5及其等位基因的存在；第二步酶切反应：于164bppcr扩增产物中加入限制性核酸内切酶xhoi(特异性识别位点“ctcgag”)，酶切反应体系为：10×nebuffer5μl，pcr扩增产物44μl，restrictionenzyme(xhoi)1μl，将反应体系在37℃条件下反应3h。然后将产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。根据表2的可能性判断是否存在纯合隐性xa5.

有益效果

本发明所提供的水稻抗白叶枯病基因的分子标记方法，具有以下优点：

(1)通过本发明分子标记定位的基因鉴定方便。由于这些标记可以特异性扩增xa5及其等位基因，通过检测扩增片段的酶切结果，可以确定抗白叶枯病基因xa5的存在与否，预测水稻植株的白叶枯病抗性，从而加快抗病育种进程。

(2)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统抗病育种方法中，对育种材料的白叶枯病抗性进行表型鉴定，一般在苗期或抽穗期，受接种环境影响较大，表型鉴定的结果可靠性低。因此抗病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗白叶枯病基因xa5，可以在苗期取样，提取dna，利用上述标记就可鉴定出抗白叶枯病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本、控制育种群体规模，而且大大提高抗白叶枯病个体的选择效率。

附图说明

图1水稻抗白叶枯病基因xa5pcr产物的的1％琼脂糖凝胶电泳图

其中：1号泳道为marker，2号泳道为irbb5抗性基因对照，3号泳道为ir24抗性等位基因对照，4-8号泳道主栽品种。

图2.水稻抗白叶枯病基因xa5pcr扩增产物的酶切片段的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

其中：1号泳道为marker，2号泳道为irbb5抗性基因对照，3号泳道为ir24抗性等位基因对照，4-8号泳道为主栽品种。

具体实施方式

实施例1

(一)材料与方法：

1.含有xa5基因的irbb5及xa5等位基因的ir24；部分生产上的主栽品种

2.dna提取方法：用ctab法提取各品种(系)的dna。

3.pcr反应体系：体积为50μl，其中10×含mg²⁺的缓冲液5.0μl，4pmol/μl的表1中所述的分子标记引物对2.0μl，10mmdntpmix1.0μl，1u/μldnapolymerase1.0μl，10ng/μl的水稻样品基因组模板dna1.0μl，加水至50μl；反应程序为：dna95℃预变性3分钟后；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸展30秒，循环35次；最后72℃延伸10分钟。在biometre扩增仪上进行pcr扩增，取6μl扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离检测，如果扩增出对应大小的分子标记dna片段，标志着xa5及其等位基因的存在

4.于条带大小相符的扩增产物中加入限制性核酸内切酶xhoi(特异性识别位点“ctcgag”)，酶切反应体系为：10×nebuffer5μl，pcr扩增产物44μl，restrictionenzyme(xhoi)1μl，将反应体系在37℃条件下反应3h。然后将产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。

(二)结果与分析：

研究结果发现，所有品种(系)的基因组dna均可以扩增出大小为164bp的条带(图1)；只有irbb5基因组dna扩增产物可以被切开，大小为143bp和21bp(图2)。说明除irbb5外，ir24及其他主栽品种中都不含有xa5抗性基因。

表2.

<110>南京农业大学

<120>水稻白叶枯抗性基因xa5的分子标记及其应用

<160>2

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>水稻白叶枯病抗性基因xa5的分子标记检测方法引物xa5-f

<400>1

agctcgccattcaagttctcg21

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>水稻白叶枯病抗性基因xa5的分子标记检测方法引物xa5-r

<400>2

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