一对塞尼卡谷病毒的RT‑PCR检测引物及RT‑PCR检测方法与流程

本发明涉及猪病毒的检测
技术领域：
，具体涉及一对塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测引物及rt-pcr检测方法。
背景技术：
：塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus，svv)属于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)senecavirus病毒属，为单股正链rna病毒，基因组全长约7.28kb，包含5’utr、3’utr和处于两者之间的单一orf，5’端有vpg蛋白共价结合，3’端有polya尾。svv最初是2002年在per.c6细胞培养物中被发现，2007年美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临床症状，经检测排除各种能引起水疱的病原，最终认定svv为致病原。但自此之后未见其他发病的报道。直至2014～2015年，巴西报道了其在涉及六个州的猪群中爆发水疱性疾病，该病有三个主要特征：(1)母猪鼻部和冠状带上出现水疱和聚合性糜烂；(2)四日龄内新生仔猪急性死亡达30％～70％；(3)自限性爆发持续时间约1～2周。官方诊断发现强制性报告的水疱性疾病均为阴性，仅svv阳性，序列分析发现其与svv-001株的核苷酸相似性为87.6％～98.5％，氨基酸相似性为95％～99.4％，说明svv是本次巴西水疱性疾病爆发的致病原，且为svv首次在北美之外被报到。美国在2014～2015年也发生了多起区域性的感染。近年已有报道显示中国境内也出现了svv的感染，但目前还没有相应的快速有效的检测手段，致使一旦有疫情爆发，不能及时的确诊病原，从而不能及时有效地采取防治措施，给养殖业带来巨大损失。可见，现有技术问题亟待解决。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题提供一对塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测引物及rt-pcr检测方法，该引物特异性好、灵敏度高且扩增片段小，整个rt-pcr检测过程可以在2h内完成，能够特异地检测出塞尼卡谷病毒，可用于实验室检测和临床辅助诊断，具有重要现实意义。本发明目的通过以下技术方案实现：一对塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测引物，其核苷酸序列为：svvup：5’-gatgtataaaccttctc-3’(seqidno：1)svvdn：5’-attgtaagtgccaagag-3’(seqidno：2)。一种塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测方法，步骤包括：(1)、设计合成所述引物(seqidno：1和seqidno：2)；(2)、提取样本rna，-20～-80℃冷冻保存备用；(3)、将(2)中所得的样本rna作为模板rna，利用(1)中所得的引物进行rt-pcr反应；(4)、电泳鉴定(3)所得的rt-pcr产物，并对结果进行判定。进一步的，所述步骤(2)提取的样本rna中保存温度为-70℃。进一步的，所述rt-pcr反应中，12.5μl反应体系为：2×1stepbuffer：6.25μl；primescript1stepenzymemix：0.5μl；svvup(10μmol/l)(seqidno：1)：0.25μl；svvdn(10μmol/l)(seqidno：2)：0.25μl；模板rna：0.5μl；无核酸酶水补足至12.5μl。进一步的，所述rt-pcr反应中，反应程序为：最后降温至4℃或16℃，一般降温至4度，样品的临时保存也可在4度，但若暂存于pcr仪中，4℃会凝结水滴，对pcr仪不好，此时设为16度保存有保护pcr仪的作用，且16度短时保存对pcr产物影响不大。进一步的，所述rt-pcr反应中，反应程序为：最后降温至4℃。进一步的，所述步骤(4)中的电泳鉴定为1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。本发明有益效果：本发明引物特异性好、灵敏度高且扩增片段小，整个rt-pcr检测过程可以在2h内完成，能够特异地检测出塞尼卡谷病毒，可用于实验室检测和临床辅助诊断，具有重要现实意义。本发明提供了一种检测塞尼卡谷病毒的方法，丰富了该病毒检测的技术手段，同时该方法特异性和灵敏度好，检测速度快，具有很好的应用价值。附图说明图1塞尼卡谷病毒rt-pcr方法特异性试验结果:m为dnamarker2000，1为阳性对照，2为阴性对照，3～7分别为口蹄疫、猪瘟、伪狂犬、蓝耳、圆环疫苗样品。图2塞尼卡谷病毒rt-pcr方法灵敏度试验结果:m为dnamarker2000，1为阴性对照，2为阳性对照，3～7分别为阳性对照的10倍梯度稀释的样品，其稀释梯度依次为：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。图3临床样品的塞尼卡谷病毒检测结果：m为dnamarker2000，1为阳性对照，2为阴性对照，3和4为临床样品。具体实施方式为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本
发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。实施例一1、引物设计：由于塞尼卡谷病毒为新发现的致病病毒，当时国内还没有建立普通pcr检测技术，genbank上能找到的基因序列也极为有限，我们将genbank上仅有的塞尼卡谷病毒svv001株和11-55910-3株的基因序列进行比对，并将其与同病毒科的多种病毒基因序列进行比对，找出其保守区域，选定svv001株的1336～1662位基因片段作为目标，然后blast进一步确定其保守性。通过oligo6.0引物设计软件在该保守序列上设计一对扩增目的带为327bp的引物svvup/svvdn，引物序列如下：svvup：5’-gatgtataaaccttctc-3’(seqidno：1)svvdn：5’-attgtaagtgccaagag-3’(seqidno：2)。2、样本rna的提取：使用axygen的dna/rna小量提取试剂盒，按照使用说明书提取模板rna，-70℃保存备用。3、rt-pcr反应：使用takara的一步法rt-pcr试剂盒，按照使用说明书以步骤(2)中所提取的样本rna作为模板rna进行rt-pcr反应。12.5μl反应体系如下：序号组分体积(μl)12×1stepbuffer6.252primescript1stepenzymemix0.53svvup(10μm)(seqidno：1)0.254svvdn(10μm)(seqidno：2)0.255模板rna0.56无核酸酶水补足至12.5经优化的反应程序如下：逆转录：50℃，30min；预变性：95℃，2min；(变性：94℃，30s；退火：56℃，30s；延伸：72℃，45s)扩增30个循环；后延伸：72℃，10min；最后降温至4℃。4、检测结果的判定：rt-pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，若能扩增出大小为327bp的单一目的条带，则判定该样品为塞尼卡谷病毒阳性。实施例二特异性检验按照实施例一所述的rt-pcr反应体系和反应程序，将样本模板rna分别换成口蹄疫、猪瘟、伪狂犬、蓝耳、圆环疫苗样品，以本实验室检测阳性并经测序鉴定过的塞尼卡谷病毒阳性样品(即之后命名为ch-01-2015株(kt321458)的病毒病料rna样品)为阳性对照，进行rt-pcr反应，rt-pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图1所示，结果显示仅阳性对照泳道327bp处出现单一条带，说明该方法特异性好。实施例三灵敏度检验按照实施例一所述的rt-pcr反应体系和反应程序，以实施例二中的阳性对照rna作为阳性对照，并将该阳性样品rna按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行10倍梯度稀释，以蒸馏水为阴性对照，进行rt-pcr反应，rt-pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图2所示。结果显示稀释100(10-2)倍条带仍较明显，稀释1000(10-3)倍仍有不明显但肉眼可见的条带，表明该方法灵敏度较高。实施例四临床样本检测按照实施例一所述的rt-pcr反应体系和反应程序进行rt-pcr反应，以实施例二中的阳性对照rna作为阳性对照，以蒸馏水为阴性对照，对两个疑似发生塞尼卡谷病毒病的临床样品进行检测，模板rna的提取参照实施例一。rt-pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳结果如图3所示。结果显示阴阳性对照成立，两个样品均为svv阳性。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。<110>广东温氏食品集团股份有限公司<120>一对塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测引物及rt-pcr检测方法<160>2<170>oligo6.0<210>1<211>17<212>dna<213>人工序列<400>1gatgtataaaccttctc17<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列<400>2attgtaagtgccaagag17当前第1页12