本发明涉及一种snp标记，尤其涉及一种与大口黑鲈生长性状相关从而进一步与易于驯食人工配合饲料相关的snp标记及其应用。
背景技术：
大口黑鲈(micropterussalmoides)，俗称加州鲈，是一种原产于北美的广温性肉食性鱼类，1983年引进到中国大陆，由于其具有生长快、肉质鲜美和易捕捞等特点，目前已成为我国主要淡水养殖品种之一。
但是，大口黑鲈作为肉食性鱼类，在养殖过程中需要利用冰鲜鱼或活鱼作为饲料的主要蛋白源，而这些冰鲜鱼或活鱼只能依靠海洋捕捞加工，这使得近几年鱼粉价格快速上升，并且供不应求。
目前，在大口黑鲈养殖领域，研究人员一直致力于开发与大口黑鲈成份相似的人工配合饲料。但是，由于大口黑鲈为肉食性鱼类，以食冰鲜鱼和活鱼为主，并不能很好的适应目前所开发的人工配合饲料，所以，投喂人工配合饲料的大口黑鲈会出现生长缓慢的现象，这一现象严重制约大口黑鲈养殖业的发展。
对大口黑鲈的人工配合饲料投喂进行研究发现，在投喂饲料的养殖过程中，从鱼苗开始，大口黑鲈存在着食性转化的过程，通常过程如下：鱼苗开口第1个星期，每天喂4次熟蛋黄，逐日有所增加；1星期后加喂剑水蚤；10天后又加入少量水蚯蚓，减少剑水蚤；20天后当鱼苗平均全长2.5厘米时，在水蚯蚓团中混入少量鲜鱼浆，以后逐日增加鲜鱼浆比例，直至全部便用鱼浆为止；大约需10天左右，开始投喂颗粒大小适口的人工配合饲料。在这过程中，由于大口黑鲈有同类相食的特点，在投喂人工配合饲料初期，快速的生长对于大口黑鲈的存活及养殖产量具有至关重要的意义。
为了解决上述问题，可以对大口黑鲈进行食性改良，通过选择育种，培育出对人工配合饲料具有良好消化能力和食欲的快长鱼类新品系。
在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可使亲鱼的遗传选择更加准确有效，加快大口黑鲈良种的进一步选育。
snp是单核苷酸多态的简称，是指在生物体的基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。单个核苷酸的变化可能会引起基因所编码蛋白氨基酸的变化或基因表达调节蛋白的结构域和结合能力的变化，进而影响蛋白结构、功能和蛋白合成量的变化，最终引起生物体表型的变化。这些snp位点的基因型有可能与生物体的表型相关联。另外，snp是可以从亲代遗传给子代的分子标记，可以通过选择含有目的性状相关的snp标记的亲本，进行繁殖，以期获得含有这一性状的子代，以加快选育的进程。
技术实现要素：
在本发明的第一方面，提供一种与大口黑鲈生长性状相关的snp标记，所述snp标记为seqidno.1序列2533bp处的碱基多态位点。
应该理解，所述snp标记也可以为seqidno.4序列上89bp处的碱基多态位点。
进一步地，上述碱基多态位点为t(胸腺嘧啶)。
进一步地，所述snp标记在seqidno.1序列的2533bp处或seqidno.4序列的89bp处为t碱基的是优势等位基因，当大口黑鲈个体只含有该snp位点为t的纯合基因型(即t/t基因型)时为目标选择个体。
更进一步地，所述snp标记可以包括上述基因序列，例如包括上述2533bp处为t的seqidno.1序列；或者例如还可以包括通过seqidno.2序列和seqidno.3序列的所扩增得到的序列(seqidno.4序列)，这样的序列可以为seqidno.4本身，也可以为包括seqidno.4序列的seqidno.1序列。
更进一步地，所述snp标记还可以包括2533bp处为t的seqidno.1序列，还可以为2533bp处为t的seqidno.1序列本身。
申请人研究发现，在大口黑鲈acsll基因序列seqidno.1的2533bp处有一个t(胸腺嘧啶)-c(胞嘧啶)型snp，该snp位于基因编码区的3’端，命名为acsll-t2533csnp位点。
申请人进一步研究发现，对大口黑鲈仔鱼进行驯食人工配合饲料的实验表明，acsll基因中2533bp处的snp位点与驯食后阶段幼鱼的生长性状有明显的相关性，该位点对应基因型为t/t基因型的个体在体质量、全长及体高性状上显著高于t/c基因型或c/c基因型的个体。
在本发明的第二方面，提供一种上述snp标记在筛选和/或检测快速生长大口黑鲈中的应用，特别是驯食人工配合饲料后的快速生长。
酰基辅酶a合成酶长链家族成员是将长链游离脂肪酸转化成乙酰coa的一个酶类家族成员，受过氧化体增殖物激活型受体α的调节，与脂蛋白脂肪酶等脂代谢关键酶共同作用，实现对体内三酰甘油代谢的调节。酰基辅酶a合成酶长链家族成员1(acyl-coasynthetaselong-chainfamilymember1，acsll)是这个家族的成员之一，在动物体内促进肝脏摄取经脂蛋白脂肪酶解生成的长键游离脂肪酸，并催化合成脂酰coa，是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，在脂肪代谢中起着重要作用。
申请人得到了上述大口黑鲈酰基辅酶a合成酶长链家族成员1(acsll)基因序列即seqidno.1的序列，研究证明了该序列的2533bp处的snp位点与大口黑鲈的生长性状的相关性，研究证实，序列acsll基因序列(seqidno.1序列)的5’端的2533bp(即3’端的741bp)对应基因型为t/t基因型的大口黑鲈个体在体质量、全长及体高性状上显著高于t/c基因型或c/c基因型个体。
通过检测大口黑鲈的上述snp标记对应的基因型，可有效筛选和/或检测得到快速生长的大口黑鲈，检测得到上述seqidno.1的序列的2533bp处对应基因型为t/t基因型的大口黑鲈为快速生长的大口黑鲈或大口黑鲈亲本。
进一步地，通过检测上述snp标记的大口黑鲈，还可选择在大口黑鲈驯食阶段能快速适应人工配合饲料的大口黑鲈或亲本。
另外，snp是可以从亲代遗传给子代的分子标记，可以通过选择含有目的性状相关的snp标记的亲本，进行繁殖，以期获得含有这一性状的子代，加快选育的进程。
本发明中优选的t/t基因型为纯合体，在后代个体遗传中不会发生分离。大口黑鲈为种内相食的鱼类，在驯食阶段能快速生长的大口黑鲈可提高其存活率，并为其在接下来继续用人工配合饲料喂食的养殖条件下能快速地生长奠定良好的基础。因此，驯食阶段能快速生长的大口黑鲈可视为易于驯食人工配合饲料的优良个体。因此，通过筛选/检测本发明的snp标记，能够用于适合驯食人工配合饲料的大口黑鲈的育种之中，可根据候选亲本在该snp标记位点上的基因型对大口黑鲈亲本进行选择，挑选含有t/t基因型大口黑鲈亲本进行繁殖，可以获得适合食人工配合饲料大口黑鲈后代鱼苗，加快培育适合食人工配合饲料大口黑鲈，促进大口黑鲈食性转化进程，节约育种时间，保护环境，降低养殖成本。
由此，本发明还提供一种上述snp标记用于鉴定和/或筛选易于驯食人工配合饲料的大口黑鲈亲本的应用，为筛选和建立大口黑鲈易驯食人工配合饲料新品系提供可靠的遗传数据。
在本发明的第三方面，提供一种检测上述snp标记的引物对。
可以理解的是，在本发明提供的上述snp标记的基础上，例如在上述seqidno.1的基础上，依据分子技术手段，可以筛选得到多对能够检测上述snp标记的引物对，例如，所述引物对包括seqidno.2序列和seqidno.3序列。经研究证明，本发明提供的该对引物对，特异性好，扩增效率高。
本发明的引物对，可以用于扩增snp标记或含有该标记的序列，或用于检测是否具有上述snp标记的大口黑鲈，从而进一步地筛选和/或检测快速生长大口黑鲈，或进一步地用于鉴定和/或筛选易于驯食人工配合饲料的大口黑鲈亲本。
在本发明的第四方面，提供一种筛选和/或检测快速生长大口黑鲈的方法，通过检测上述的snp标记，选择具有上述snp标记的大口黑鲈作为快速生长大口黑鲈，进一步地，选择具有seqidno.1序列的2533bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型或seqidno.4序列的89bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型的大口黑鲈作为快速生长大口黑鲈或亲本。本发明还提供一种用于鉴定和/或筛选易于驯食人工配合饲料的大口黑鲈亲本的方法，通过检测上述的snp标记，选择具有上述snp标记的大口黑鲈作为驯食人工配合饲料的大口黑鲈亲本，进一步地，选择具有seqidno.1序列的2533bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型或seqidno.4序列的89bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型的大口黑鲈作为驯食人工配合饲料的大口黑鲈或亲本。
在分子技术领域，具有多种检测上述snp标记的方法，例如pcr后直接测序的方法等。
进一步地，可以采用seqidno.2序列和seqidno.3序列的引物对进行snp标记检测，检测snp标记的基因型。
进一步地，上述检测snp标记的方法包括：提取大口黑鲈dna、采用seqidno.2序列和seqidno.3序列的引物对进行pcr扩增，选择具有seqidno.1序列的2533bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型或seqidno.4序列的89bp处碱基多态位点对应基因型为t/t基因型的大口黑鲈作为快速生长大口黑鲈或亲本，或作为驯食人工配合饲料的大口黑鲈或亲本。
在一个优选的实施例中，提供一种检测该snp标记的方法，包括：
(1)提取检测样本dna，例如剪取检测样品的鱼鳍进行样本dna提取；
(2)利用下面两对引物对，对提取的dna进行pcr扩增，获取具有snp位点的目标片段；
引物1：5’-ctgccatcactggcttattag-3’(seqidno.2)
引物2：5’-ctttctgaccatgacatagtca-3’(seqidno.3)
(3)可选地对上述pcr产物进行纯化后，进行目标片段的测序比对，分析检测样本的snp标记位点的基因型，确定检测样本是否具有本发明所述的优选的snp标记；
具体地，例如检测出大口黑鲈个体的snp位点碱基多态位点只有t时，即标记位点对应基因型为t/t基因型，则判定该检测样本为生长快速的大口黑鲈，适合驯食人工配合饲料，可选做亲本。
在另一个优选的实施例中，上述方法中的pcr扩增反应体系为可以为25μl的反应体系，例如：
在另一个优选的实施例中，上述方法中的pcr扩增反应条件可以为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。
在本发明的第五方面，提供一种筛选和/或检测快速生长大口黑鲈或亲本的试剂盒，所述试剂盒包括检测具有上述的snp标记的试剂，这样的试剂可以包括例如包括引物对在内的pcr扩增试剂、样本dna提取试剂等，这样的试剂还可以考虑为实现上述筛选和/或检测快速生长大口黑鲈或亲本的方法的任何试剂及其组合，可以考虑为鉴定和/或筛选易于驯食人工配合饲料的大口黑鲈或亲本的方法的任何试剂及其组合。
本发明创造性地提供了一种与大口黑鲈的生长性状相关的snp标记，不同的基因型与大口黑鲈的生长性状的相关性已经得到证实，在此基础上，利用该snp标记，可以进行大口黑鲈的筛选或检测，或大口黑鲈的人工养殖过程中易于驯食人工配合饲料的大口黑鲈或其亲本的筛选或检测，在大口黑鲈的养殖或选育领域，都具有积极的效果，及在此基础上，开发了一系列的引物对、方法及相应试剂盒，具有很大的科学价值和商业价值。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1本发明snp标记的作用研究
对大口黑鲈催产和人工繁育，将大口黑鲈仔鱼从3-5cm左右的鱼苗开始驯食人工饲料，全程投喂市售大口黑鲈配合饲料。在2周的驯食人工配合饲料后，随机取97尾大口黑鲈鱼苗测定其体质量、全长、体高等生长指标，并取鱼鳍提取基因组dna，检测seqidno.1的2533bp处的snp位点的等位基因和基因型频率见表1，snp位点的几种基因型及相应的体重、体长、体高指标见表2。
表197尾大口黑鲈仔鱼acsll-t741csnp位点在的等位基因和基因型频率
表2acsll-t741csnp位点与大口黑鲈仔鱼生长性状的相关关系
注：表中上标为平均值的差异显著性(最小显著差数法，lsd)，同一列数值中，上标含相同字母表示两种基因型之间差异不显著(p>0.05)，不同小写字母代表差异显著(p≤0.05)。
从以上结果可以看出，acsll-t2533csnp位点与大口黑鲈生长形状关系密切，该位点对应基因型是t/t基因型时为优势基因型，是t/c基因型和c/c基因型时为劣势基因型。
因此，acsll-t2533c(seqidno.1的2533bp)snp位点仅检测出t时，也就是其对应的基因型为t/t基因型为生长性状更快速的大口黑鲈，而acsll-t2533csnp(seqidno.1的2533bp)snp位点不止为t，还包括c，或者只有c时，也就是说其对应基因型为t/c、c/c基因型时，为生长性状更缓慢的大口黑鲈。
此外，对于投喂冰鲜杂鱼的大口黑鲈的上述snp位点基因型和生长性状进行同样的试验，得到了相似的结果。
实施例2本发明snp标记的筛选研究
本实施例对大口黑鲈的snp标记进行筛选/检测：
(一)样品dna的提取
(1)取待检测样本大口黑鲈的鳍条组织3mg，剪碎后，加入0.5ml的裂解液(10mmol/ltris-hcl；0.1mol/ledta；0.5％sds；30mg/lrnase；100mg/l蛋白酶k，ph8.0)，55℃消化1小时；
(2)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；
(3)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀dna，12000转/分钟离心10分钟，得到沉淀；
(4)将沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μlte(10mmol/ltris－hcl；1mmol/ledta，ph8.0)溶解，得到dna液，可4℃贮存备用。
(二)引物的设计与合成
根据大口黑鲈acsll基因序列(seqidno.1)设计并合成一对引物，用于扩增seqidno.1的2533bp或seqidno.4的89bp位置的snp位点，引物序列如下：
引物1：5’-ctgccatcactggcttattag-3’(seqidno.2)
引物2：5’-ctttctgaccatgacatagtca-3’(seqidno.3)
(三)pcr反应：
反应体系(25μl体系)
pcr反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒，32个循环；72℃延伸7min。
(四)大口黑鲈的基因型分析(筛选/检测)
测序步骤(三)得到的pcr扩增产物(即seqidno.4序列)，查看测序峰图，分析每尾大口黑鲈的基因型，根据seqidno.1序列或seqidno.4与测得序列的比较结果，在seqidno.1序列的2533pb为t单峰的个体是t/t基因型个体，tc双峰的个体是t/c基因型个体，c单峰的个体是c/c基因型个体。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所公司
<120>一种与大口黑鲈生长性状相关的snp标记及其应用
<160>4
<210>1
<211>3273
<212>dna
<213>大口黑鲈(micropterussalmoides)
<220>
<223>snp标记序列
<400>1
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<223>snp标记序列
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