进行VDR基因rs2228570位点多态性的分型检测方法与流程

本发明涉及基因检测技术领域，具体是进行vdr基因rs2228570位点多态性的分型检测方法。

背景技术：

维生素d是脂溶性的类固醇类激素，是人体不可或缺的一种维生素，人体内的维生素d可通过有限的食物或皮肤在阳光照射下合成获得。维生素d的典型生物学功能是调节机体钙磷代谢，它与钙、磷共同作用，可调节发育，强化骨骼和牙齿，有效的预防佝偻病和骨质疏松的发生。此外维生素d还具有调节生殖、免疫、内分泌、神经等功能。

维生素d生物功能的发挥，需要通过vdr蛋白的介导。vdr蛋白与维生素d结合，可激活人体重要的钙调节激素骨化三醇的活性，促进肠道对钙的吸收并调节骨的无机盐代谢。研究发现rs2228570位点位于vdr蛋白翻译的起始位点，位点变异将导致合成vdr蛋白的结构发生变化，因而影响其生物学功能的正常发挥。若体内vdr蛋白结构异常，将会影响维生素d与vdr的结合，因而影响维生素d生物学功能的正常发挥，从而导致机体免疫状态失常，骨骼健康受损。研究表明，vdr基因的多态性与骨密度之间存在相关性，影响青少年骨量的形成，此外vdr基因变异与骨质疏松、骨质疏松性骨折、前列腺癌、乳腺癌、甲状旁腺激素分泌异常，糖尿病和冠心病等也有相关性。因此，建立简单、快捷的钙代谢关键基因vdr多态性位点的检测方法，能检测出钙及维生素d疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出相关高危人群，有针对性的进行指导，对于疾病的预防、特别是保障青少年和妇女群体的安全健康具有重要的意义。目前，基因多态性检测的方法主要有最常用的基因多态性检测方法为测序法，该方法优势是可以同时进行高通量多位点的检测，但其操作复杂耗时长且灵敏度低，容易出现样本间交叉污染且不能实现样本的快速检测；高分辨率溶解曲线法快速、简便、经济实用，但是它对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重复性好、灵敏度高的进行vdr基因rs2228570位点多态性的分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

进行vdr基因rs2228570位点多态性的分型检测方法，采用vdr基因特异性的引物seq1和seq2扩增vdr基因片段，同时在vdr基因特异性的引物界定的扩增区域内设计vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位点为a，则vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为a；若位点为g，则vdr基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述vdr基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-cctgcttgctgttcttac-3´；

所述vdr基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-caaagtctccagggtcag-3´；

所述vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ccgccattgcctccatc-3´；

所述vdr基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-cgccattgcctccgtc-3´。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型的方法，本发明采用vdr特异性的基因扩增和taqman探针，基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

附图说明

图1为本发明实施例中人vdr-rs2228570位点aa基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图2为本发明实施例中人vdr-rs2228570位点ag基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图3为本发明实施例中人vdr-rs2228570位点gg基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图4为本发明实施例中人vdr-rs2228570位点的检测结果分布示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-4，进行vdr基因rs2228570位点多态性的分型检测方法，采用vdr基因特异性的引物seq1和seq2扩增vdr基因片段，同时在vdr基因特异性的引物界定的扩增区域内设计vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位点为a，则vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为a；若位点为g，则vdr基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述vdr基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-cctgcttgctgttcttac-3´；

所述vdr基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-caaagtctccagggtcag-3´；

所述vdr基因特异性taqman探针seq3-fam-a的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ccgccattgcctccatc-3´；

所述vdr基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-cgccattgcctccgtc-3´。

实施例：

（1）测试用正常人基因组dna制备：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制备，正常人基因组dna浓度稀释到10ng/μl。

（2）pcr特异性引物和探针设计合成

根据人vdr基因序列设计合成基因特异性引物seq1、seq2和vdr特异性taqman基因探针标记seq3-fam-a和seq4-vi-g。

（3）vdr定量pcr检测

1）引物探针混合物配置：

2）反应体系：引物探针混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，标准模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr仪：abi7500。

4）反应条件：95℃、2min；95℃、15s——60℃、32s，42循环。

（4）基因验证结果读取：

参见图1，图1中横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，检测到vic、fam信号确定为扩增成功。根据样本fam/vic比值确定具体样本的基因型。

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型的方法，本发明采用vdr特异性的基因扩增和taqman探针，基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。