一组SNP位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用的制作方法

本发明涉及一组snp位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用。

背景技术：

snp(singlenucleotidepolymorphism)，即单核苷酸多态性，具有分布密度高、遗传稳定性强、检测通量高、数据容易整合和标准化等特点，被认为是最有效dna标记方法之一，在作物的品种鉴定中得到应用，也被国际植物新品种保护联盟(upov)被推荐作为品种鉴定和数据库构建的优选标记。目前针对snp的分型检测方法有多种，不同的方法在检测通量及成本上差异较大，其中kasp分型法是比较经济适用的方法之一，具有位点扩展性性强、操作便捷、结果容易分析等特点，尤其适合大量样本的少量snp位点的分析。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一组小麦snp位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用。

本发明提供了一种用于检测16个snp位点的产品在小麦品种鉴定中的应用；

所述16个snp位点如下所示：

第1个snp位点：小麦基因组中序列表中序列1自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态；

第2个snp位点：小麦基因组中序列表中序列2自5’端第51位核苷酸，该snp为a/c多态；

第3个snp位点：小麦基因组中序列表中序列3自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态；

第4个snp位点：小麦基因组中序列表中序列4自5’端第51位核苷酸，该snp为a/g多态；

第5个snp位点：小麦基因组中序列表中序列5自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态；

第6个snp位点：小麦基因组中序列表中序列6自5’端第51位核苷酸，该snp为a/g多态；

第7个snp位点：小麦基因组中序列表中序列7自5’端第51位核苷酸，该snp为a/c多态；

第8个snp位点：小麦基因组中序列表中序列8自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态；

第9个snp位点：小麦基因组中序列表中序列9自5’端第51位核苷酸，该snp为t/g多态；

第10个snp位点：小麦基因组中序列表中序列10自5’端第51位核苷酸，该snp为t/g多态；

第11个snp位点：小麦基因组中序列表中序列11自5’端第51位核苷酸，该snp为a/c多态；

第12个snp位点：小麦基因组中序列表中序列12自5’端第51位核苷酸，该snp为a/g多态；

第13个snp位点：小麦基因组中序列表中序列13自5’端第51位核苷酸，该snp为a/g多态；

第14个snp位点：小麦基因组中序列表中序列14自5’端第51位核苷酸，该snp为t/g多态；

第15个snp位点：小麦基因组中序列表中序列15自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态；

第16个snp位点：小麦基因组中序列表中序列16自5’端第51位核苷酸，该snp为t/c多态。

所述“用于检测16个snp位点的产品”为引物组合；所述引物探针组合由16个引物组组成；

引物组1由引物f1-1、引物f1-2和引物r1组成；所述引物f1-1为序列表的序列17所示的单链dna分子；所述引物f1-2为序列表的序列18所示的单链dna分子；所述引物r1为序列表的序列19所示的单链dna分子；

引物组2由引物f2-1、引物f2-2和引物r2组成；所述引物f2-1为序列表的序列20所示的单链dna分子；所述引物f2-2为序列表的序列21所示的单链dna分子；所述引物r2为序列表的序列22所示的单链dna分子；

引物组3由引物f3-1、引物f3-2和引物r3组成；所述引物f3-1为序列表的序列23所示的单链dna分子；所述引物f3-2为序列表的序列24所示的单链dna分子；所述引物r3为序列表的序列25所示的单链dna分子；

引物组4由引物f4-1、引物f4-2和引物r4组成；所述引物f4-1为序列表的序列26所示的单链dna分子；所述引物f4-2为序列表的序列27所示的单链dna分子；所述引物r4为序列表的序列28所示的单链dna分子；

引物组5由引物f5-1、引物f5-2和引物r5组成；所述引物f5-1为序列表的序列29所示的单链dna分子；所述引物f5-2为序列表的序列30所示的单链dna分子；所述引物r5为序列表的序列31所示的单链dna分子；

引物组6由引物f6-1、引物f6-2和引物r6组成；所述引物f6-1为序列表的序列32所示的单链dna分子；所述引物f6-2为序列表的序列33所示的单链dna分子；所述引物r6为序列表的序列34所示的单链dna分子；

引物组7由引物f7-1、引物f7-2和引物r7组成；所述引物f7-1为序列表的序列35所示的单链dna分子；所述引物f7-2为序列表的序列36所示的单链dna分子；所述引物r7为序列表的序列37所示的单链dna分子；

引物组8由引物f8-1、引物f8-2和引物r8组成；所述引物f8-1为序列表的序列38所示的单链dna分子；所述引物f8-2为序列表的序列39所示的单链dna分子；所述引物r8为序列表的序列40所示的单链dna分子；

引物组9由引物f9-1、引物f9-2和引物r9组成；所述引物f9-1为序列表的序列41所示的单链dna分子；所述引物f9-2为序列表的序列42所示的单链dna分子；所述引物r9为序列表的序列43所示的单链dna分子；

引物组10由引物f10-1、引物f10-2和引物r10组成；所述引物f10-1为序列表的序列44所示的单链dna分子；所述引物f10-2为序列表的序列45所示的单链dna分子；所述引物r10为序列表的序列46所示的单链dna分子；

引物组11由引物f11-1、引物f11-2和引物r11组成；所述引物f11-1为序列表的序列47所示的单链dna分子；所述引物f11-2为序列表的序列48所示的单链dna分子；所述引物r11为序列表的序列49所示的单链dna分子；

引物组12由引物f12-1、引物f12-2和引物r12组成；所述引物f12-1为序列表的序列50所示的单链dna分子；所述引物f12-2为序列表的序列51所示的单链dna分子；所述引物r12为序列表的序列52所示的单链dna分子；

引物组13由引物f13-1、引物f13-2和引物r13组成；所述引物f13-1为序列表的序列53所示的单链dna分子；所述引物f13-2为序列表的序列54所示的单链dna分子；所述引物r13为序列表的序列55所示的单链dna分子；

引物组14由引物f14-1、引物f14-2和引物r14组成；所述引物f14-1为序列表的序列56所示的单链dna分子；所述引物f14-2为序列表的序列57所示的单链dna分子；所述引物r14为序列表的序列58所示的单链dna分子；

引物组15由引物f15-1、引物f15-2和引物r15组成；所述引物f15-1为序列表的序列59所示的单链dna分子；所述引物f15-2为序列表的序列60所示的单链dna分子；所述引物r15为序列表的序列61所示的单链dna分子；

引物组16由引物f16-1、引物f16-2和引物r16组成；所述引物f16-1为序列表的序列62所示的单链dna分子；所述引物f16-2为序列表的序列63所示的单链dna分子；所述引物r16为序列表的序列64所示的单链dna分子。

本发明还保护所述引物组合。

本发明还保护所述引物组合在小麦品种鉴定中的应用。

本发明还保护所述引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途为鉴定小麦品种。

本发明保护一种鉴定小麦品种的方法(方法甲)，包括如下步骤：检测待测小麦品种在所述16个snp位点上的基因型；根据基因型确定待鉴定小麦的品种。

本发明还保护一种鉴定小麦品种的方法(方法乙)，包括如下步骤：提取待鉴定小麦品种的基因组dna；利用所述引物组合对所述基因组dna分别进行所述16个snp位点的检测，从而获得待测小麦品种在所述16个snp位点上的基因型数据；根据基因型数据确定待鉴定小麦的品种。

所述方法乙具体包括如下步骤：(1)提取待鉴定小麦品种的基因组dna；(2)以步骤(1)得到的基因组dna为模板，依次采用所述引物组合中的每个snp位点对应的各条引物对模板进行kasppcr扩增；(3)对步骤(2)得到的扩增的荧光信号进行收集和分析，获得待测小麦品种在所述16个snp位点上的基因型数据，根据基因型数据确定待鉴定小麦的品种。

所述kasppcr反应体系具体可为：pcr混合液(kasp2×mastermix)(英国laboratoryofthegovernmentchemist，货号：kbs-1016-002)2.5μl，正向引物1和正向引物2各0.2μl(终浓度0.2μm)，反向引物0.3μl(终浓度0.3μm)，模板0.5μl(dna含量为25-50ng/μl)，ddh2o1.3μl,总体积5μl。

所述kasppcr扩增可在abi-viia7实时荧光定量pcr仪上进行，由仪器自带的viia^tm7softwarev1.2.2软件对扩增的荧光信号进行收集和分析(参照软件使用说明书)。

本发明还保护一种用于鉴定小麦品种的试剂盒，包括权利要求所述引物组合及记载有所述方法乙的说明书。

以上任一所述小麦品种具体可为表1中所示的小麦品种。

本发明通过snp芯片技术筛选出适合品种鉴定的多态性snp位点，根据snp位点dna序列信息设计kasp分型引物，再利用kasp分型技术对44个审定小麦品种进行了鉴定分析，评价引物鉴别能力，构建了一组适合小麦品种鉴定snp位点组合及快速分型方法，为小麦品种室内快速鉴定提供技术支撑。

附图说明

图1为44个小麦品种bs00074301_51位点的基因分型图。

图2为16个snp位点对44个小麦品种遗传聚类分析结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例中的44个小麦品种见表1。表1中的所有品种均可从北京种子管理站农作物标准样品库获得。

表144个小麦品种及来源

实施例1、用于小麦品种鉴定的snp位点的开发

取22个小麦常规种(编号1-22)和2个杂交种(编号7，8)及其亲本作为位点筛选材料，按照illumina公司提供的基于光纤微珠芯片infinium技术的操作流程进行，利用小麦illumina90k全基因组snp芯片对这28个小麦品种进行分型鉴定，用iscan芯片扫描仪扫描分型结果，获得原始数据。用genomestudio软件进行数据分析，获得待测样品snp位点的基因型数据。

结果显示，在81587个snp位点中，平均数据获得率(callrate值)为92.8％，其中16499个位点表现出多态性(表现为2或3种基因型),多态性位点比率为20.2％。根据多态性位点数据缺失率(低于5％)、重复性、信号强度、以及是否符合遗传规律，筛选出3467个snp位点作为小麦品种鉴定的候选位点，并从中挑选16个基因型分布较为均匀(每种基因型比率不小于5％)的snp位点(见表2)。

表2snp位点信息

实施例2、用于小麦品种鉴定的引物的开发

针对实施例1筛选得到的16个snp位点设计引物，具体如表3所示。

每个snp位点共有3个引物，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。

表3中的各条引物在使用时均以工作液的形式加入至反应体系中，引物在工作液的浓度均为5μm。

实施例3、小麦品种鉴定

1、提取表1中各小麦品种的基因组dna。

2、以步骤1得到的基因组dna为模板，依次采用表3中每个snp位点对应的各条引物对模板进行kasppcr扩增。

kasppcr反应体系(5μl)：pcr混合液(kasp2×mastermix)(英国laboratoryofthegovernmentchemist，货号：kbs-1016-002)2.5μl，正向引物1和正向引物2各0.2μl(终浓度0.2μm)，反向引物0.3μl(终浓度0.3μm)，模板0.5μl(dna含量为25-50ng/μl)，ddh2o1.3μl。

扩增反应在abi-viia7实时荧光定量pcr仪上进行，由viia^tm7softwarev1.2.2对扩增的荧光信号进行收集和分析。采用powermarker3.25软件计算snp位点的多态性信息含量(pic)，ntsys-pcversion2.0软件计算品种间的遗传相似性系数并进行遗传聚类分析。

44个小麦品种在表2中编号为11的bs00074301_51位点的分型图如图1所示。遗传聚类分析结果如图2所示(图2中，右侧数字对应表1中的小麦品种编号)。结果显示16个snp位点在这些品种中的平均数据获得率为98.6％，多态性信息量(pic)变幅为0.34-0.375之间，平均为0.365(表2)，均为中高度多态性信息引物。品种间遗传相似性系数介于0.167-0.96之间，平均遗传相似性系数为0.522，遗传聚类分析结果显示44个小麦品种之间至少有1个以上差异位点，说明该16个snp位点组合具有较强的品种鉴别能力，能正确将44个小麦品种鉴别开，适合小麦品种鉴定。

<110>北京市种子管理站

<120>一组snp位点基因分型引物及其在小麦品种鉴定中的应用

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<400>41

agcgagctagagaggaagtgaaat24

<210>42

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>42

gcgagctagagaggaagtgaaac23

<210>43

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>43

tcgctgtccatcattcacctgctt24

<210>44

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>44

ccagattccatagttctgattcttcat27

<210>45

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>45

cagattccatagttctgattcttcag26

<210>46

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>46

ttgccgggtggatgtccggaat22

<210>47

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>47

cgcccaagttcatgtccgcat21

<210>48

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>48

cgcccaagttcatgtccgcag21

<210>49

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>49

cgtccagtaagctgtgaagaaggaa25

<210>50

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>50

gtagtttcaccagctgcctagaaa24

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>51

agtttcaccagctgcctagaag22

<210>52

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>52

ctggaacgagcatagcaaaatcaaactta29

<210>53

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>53

ttataagagagaaatcatttgcagcaagt29

<210>54

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>54

ataagagagaaatcatttgcagcaagc27

<210>55

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>55

cgtccatactcgttcttatgcatacaata29

<210>56

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>56

gttcttgtgctcatgcttgtctact25

<210>57

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>57

cttgtgctcatgcttgtctacg22

<210>58

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>58

ggactacctcggggtggagata22

<210>59

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>59

cgtgagcgcgattaacatatgttcat26

<210>60

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>60

gtgagcgcgattaacatatgttcac25

<210>61

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>61

agccgatcgatctctgtgtcttatattat29

<210>62

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>62

gtatttccgaccaccgcggta21

<210>63

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>63

gtatttccgaccaccgcggtg21

<210>64

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>64

tctgcgagatgcatgctaaggcaaa25