青光眼诊断分子标记物lncRNAsENST00000564363、试剂盒及应用的制作方法

技术领域：
:本发明涉及分子诊断
技术领域：
，具体涉及一种有助于青光眼诊断的长链非编码rna标志物、试剂盒及应用。
背景技术：
：:眼睛是人体十分重要的感觉器官，能够接受外部的光刺激，并将光冲动传送到大脑中枢而引起视觉。达芬奇曾说：“眼睛是心灵的窗户，通过眼睛，人们得以拥抱和欣赏世界的无限美妙，灵魂才得以安居于体内”。信息时代，人通过感觉器官从外界获得的信息中，大约90％是由眼睛来完成的。世界卫生组织的资料显示，眼科疾病已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位危害及影响人们生存质量的疾病。在所有眼科疾病中，青光眼则是首位不可逆转的致盲性眼病，其影响视觉质量的原因是通过威胁和损害视神经及其通路而导致失明，从而严重威胁人类的视觉健康，给个人、家庭和社会造成难以估量的损失。青光眼造成的主要危害是影响视觉功能，即便是在发达国家中，也只有50％左右的青光眼患者能够得到及时的诊断和治疗，而且，青光眼的发病因素、遗传学规律等均不明了，因此我们要科学地掌握其发生发展规律，从而进行早期诊断和早期治疗，避免青光眼患者的失明。目前，青光眼的诊断主要是依靠病史、形态学和功能学方面的检查，如眼压测量、超声生物显微镜、眼底照相、光学相干断层扫描和视野检查等。虽然这些检查可以诊断青光眼，但研究表明，通过形态学和功能学手段诊断的青光眼，患者视觉功能的损害已经超过50％。而青光眼相关的生化检查、血清学筛查及检测标准仍处于相对空白状态，因此寻找一种高灵敏度和高特异性的标志物对青光眼诊断和监控尤为重要。基因组计划研究表明，在组成人类基因组的30亿个碱基对中，仅有1.5％的核苷酸序列用于蛋白质编码，其余98.5％的基因组为非蛋白编码序列。这些序列曾被认为是在进化过程中累积的“垃圾序列”而未予以关注，在随后启动的人类基因组dna元件百科全书(encyclopediaofdnaelements,encode)计划中，研究表明75％的基因序列能够被转录成rna，其中近74％的转录产物为非编码rna(non-codingrnas，ncrnas)。在ncrna中，序列长度大于200个碱基的转录本为长链非编码rnas(longnoncodingrna,lncrnas),它们由于功能的丰富性及作用机制的多样性而备受关注。lncrnas能够在转录、转录后和翻译多个层面上调节蛋白编码基因的表达，从而广泛地参与包括细胞分化和机体发育在内的重要生命过程，其异常表达还与人类多种重大疾病的发生密切相关。lncrna具有高度保守性及组织特异性，在脑部含量非常丰富。lncrna不仅参与了神经系统的生长发育和功能完善，使神经系统按照一定的时间顺序和在一定的空间内进行生长和发育，并且参与执行神经系统的功能。lncrna通过多种机制参与到神经系统的发育及功能执行中，包括作为顺式作用元件及反式作用因子参与基因印记、染色质重塑、细胞周期调控、剪接调控、mrna降解和翻译调控等过程。因此，利用检测lncrnas的组成及表达水平的变化来反映神经系统的生理及病理状态是可行的手段。房水属于眼内容物，由睫状体产生，经过瞳孔、小梁网等最终进入血液，且处于动态循环之中，其成分构成与眼球局部生理及病理环境密切相关。外泌体作为机体至关重要的细胞间相互交流的中介物质，包含了lncrnas、mrnas、蛋白质及脂质等。外泌体内包含的物质由于特殊保护机制能长期保持稳定状态。因此，房水中的lncrnas等分子可以外泌体的形式传递细胞间的相互交流信息，并可随房水的动态循环进入血液。因此青光眼相关的lncrnas研究具有为青光眼相关生物标志物检测提供理论基础的潜能。技术实现要素：本发明的目的之一是提供一种用于青光眼早期诊断的长链非编码rna，对青光眼的发病检测有重要意义。用于青光眼早期诊断的分子标记物lncrnasenst00000564363，其序列如seqidno:1所示。本发明的目的之二是提供上述分子标记物lncrnasenst00000564363的应用。检测lncrnasenst00000564363表达水平的产品在制备青光眼早期诊断工具中的应用。所述的检测lncrnasenst00000564363表达水平的产品包括：通过实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的制剂。所述的通过实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的制剂包括特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物。用实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物序列为：f:5'acaaaaaacataaaggccggg3’，r:5’agagcacccccaagccct3’。本发明的目的之三是提供一种用于青光眼早期诊断的试剂盒，包含检测lncrnasenst00000564363表达水平的试剂。具体是包含通过实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的试剂。所述的通过实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的试剂包含通过实时荧光定量pcr特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物。所述的通过实时荧光定量pcr检测lncrnasenst00000564363表达水平的试剂包含一对通过实时荧光定量pcr特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物，其引物序列为：f:5'acaaaaaacataaaggccggg3’，r:5’agagcacccccaagccct3’。申请人发现相对于对照组人群，lncrnas:enst00000564363在青光眼患者的房水中表达上调。提示enst00000564363是青光眼中的高表达lncrnas，是有助于青光眼诊断的生物标志物。本发明为青光眼诊断提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。附图说明图1为青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表达谱；a：青光眼患者房水中lncrnas表达谱分析聚类图；b：青光眼患者房水中mrnas表达谱分析聚类图。图2为青光眼患者房水中差异表达的lncrnas和mrnas；a：较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍差异表达的lncrnas；b：较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍差异表达的mrnas。图3为青光眼患者房水中lncrnas和mrnas表达的cnc分析图；红色点代表lncrnas，蓝色点代表mrnas，实线代表正相关，虚线代表负相关。图4为lncrnas在青光眼及年龄相关性白内障患者房水中的表达量；a-d为：lncrna:enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241在青光眼及年龄相关性白内障患者房水中表达的散点图。图5为利用lncrnas在房水中诊断青光眼的roc曲线；a-d为：lncrnaenst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241在房水样本中诊断青光眼的roc曲线下面积分别为1.000、0.920、0.940和0.880。具体实施方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1：青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表达谱：1.1材料与试剂1.1.1主要仪器常用离心机及低温离心机购自eppendorf公司；高速离心机购自beckman公司；real-timepcr仪器购自abi公司；移液器和电动移液枪购自eppendorf公司；q5000购自quawelltechnology公司；制冰机购自sanyan公司。1.1.2材料与试剂不同型号的离心管及pcr管均购自axygen公司；depc水购自鼎国昌盛公司；trizol购自invitrogen公司；targetamptm1-roundarnaamplification试剂盒购自epicentre公司；transcriptorfirststrandcdnasynthesis试剂盒购自roche公司；quickamplabelingkit,one-color试剂盒购自agilenttechnologies公司；人lncrnasmicroarray芯片购自arraystar公司。1.1.3试剂配置各种免疫印迹所用试剂根据《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。1.2方法1.2.1房水样本准备该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批。术前与所有研究对象签署知情同意书，在正式手术步骤开始前利用1ml的一次性无菌注射器于角膜缘抽取未稀释的房水标本0.1ml，立即注入高压灭菌的0.5mlep管中，置于-80℃低温冰箱避光保存备用。所有入选患者为在我院住院需要进行手术治疗的青光眼患者和年龄相关性白内障患者。纳入标准：1.原发性开角型青光眼：a.眼压>21mmhgb.青光眼性视盘损害和/rnfl缺损c.典型的青光眼性视野缺损d.前房角开放。具有以上四项或具有其中的a,d,b或c者。2.正常眼压性青光眼：具有类似于poag的视盘改变，rnfl及视野损害，24h眼压测量均≤21mmhg,房角开放。3.原发性闭角型青光眼：具有青光眼的视盘改变，rnfl及视野损害，眼压>21mmhg,前房角变窄或关闭4.年龄相关性白内障(对照组)：晶状体呈皮质性和/或核型浑浊和/或后囊下性混浊。排除标准：1.伴发全身性疾病如高血压和糖尿病等。2.继发性青光眼3.可能影响视野、视神经或色觉的眼科或神经科疾病。4.视野检测可靠性标准：固视丢失率、假阳性率和/或假阴性率>25％。5.年龄相关性白内障：排除并发性、外伤性、先天性白内障并排除伴有其他眼内疾病者、排除过熟期病例。1.2.2rna提取取房水0.1ml加入0.5mltrizol试剂，剧烈震荡后加入0.1毫升氯仿。而后经离心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于10微升dpec水，经q5000仪器测量各管rna浓度。1.2.3rna扩增使用targetamptm1-roundarnaamplificationkit103(epicentre)按生厂商说明书所示步骤对rna进行扩增。大致步骤如下：首先根据rna样本合成单成单链cdna:rna杂交产物，然后使用rnaseh酶将上述杂交产物消化为小片段序列，这些小片段序列可协助双链cdna的合成。最后由双链cdna转录合成反义rna。1.2.4cdna合成和标记使用transcriptorfirststrandcdnasynthesiskit(roche)按生厂商说明书所示步骤合成cdna。使用quickamplabelingkit,one-color(agilenttechnologies)对合成的cdna进行标记。1.2.5标记效率质量检测取1.5微升已标记的cdna样本，使用nanodropnd-1000检测荧光标记效率。1.2.6芯片杂交在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片(humanlncrnamicroarrayv4.0,arraystar公司)进行杂交。该芯片共检测40173种lncrnas及20730种mrnas表达水平。1.2.7图像采集和数据分析使用genepix4000b芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存。p值<0.05为差异有统计学意义。1.3结果1.3.1青光眼患者房水中lncrnas及mrnas的表达谱在10份青光眼患者房水样本中平均检测到20653±569.9种lncrnas和11265±268.3种mrnas。其中，10份青光眼患者房水样本中均检测到的lncrnas为11728种，均检测到的mrnas为6686种。1.3.2青光眼患者房水中差异表达的lncrnas及mrnas较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍上调表达的lncrnas为4372种，2倍下调表达的lncrnas为2602种。较年龄相关性白内障而言，青光眼患者房水中2倍上调表达的mrnas为2783种，2倍下调表达的mrnas为1617种。1.4结果由于其易取性、个体特异性及相对受机体其他器官影响较小的特点，房水是一种眼部疾病生物标志物相关研究的价值较大的研究对象。并且，尽管目前已有多种研究报道青光眼相关的流行病学及遗传学危险因素，但以房水为研究对象的相关研究相对较少。因此，我们认为房水具有应用于今后青光眼相关遗传学研究的潜能。由于取样的限制，人源性房水样本体积较小。为克服该问题，我们在进行芯片杂交前增加rna扩增步骤，如此以保证后续步骤的顺利进行。通过使用lncrnas芯片微阵列分析方法，11728种lncrnas及6686种mrnas在10份青光眼房水样本中均检测到，这与年龄相关性白内障患者房水中lncrnas和mrnas表达谱具有显著差异，因此房水中lncrnas和mrnas表达谱表现出个体特异性及疾病特异性。就我们所知，这是第一个青光眼房水相关lncrnas和mrnas表达谱研究。实施例2：通过cnc分析明确房水中特定lncrnas与mrnas的相关性为进一步探讨青光眼患者房水中表达的lncrnas的可能功能，我们运用cnc(coding-noncodinggeneco-expression)分析明确与青光眼相关基因的mrnas表达具有显著相关性的lncrnas。cns分析是一种通过lncrna和mrna共表达数据，将lncrna与mrna联系起来的分析方法。通过cnc分析可以发现与某个lncrna具有相同表达模式的mrna，通过这些mrna的功能，可以将lncrna与特定信号通路或疾病状况联系起来，从而便于预测lncrna的功能，并揭示其作用机制。2.1方法挑选房水中差异表达并且与青光眼发生发展具有相关性的mrnas，将这些mrnas在不同青光眼患者房水中的表达数据求平均值；求挑选出的mrnas标准化之后的数据与青光眼患者房水中差异表达的lncrnas相关数据之间的皮尔逊相关系数(pearsoncorrelationcoefficient,pcc)与错误发现率(falsediscoveryrate,fdr)；挑选出pcc≥0.90并且fdr≤0.05的记录；使用相关记录，利用cytoscape2.8.3工具绘图。2.2结果较年龄相关性白内障而言，在青光眼患者房水中差异表达且与青光眼发生发展具有相关性的mrnas为如下十种：骨形态生成蛋白2(bonemorphogeneticprotein2,bmp2)、室管膜相关基因1(ependyminrelated1,epdr1)、转化生长因子β1(transforminggrowthfactorbeta1,tgfb1)、叉头蛋白e3(forkheadboxe3,foxe3)、生长激素促分泌素受体(growthhormonesecretagoguereceptor,ghsr)、叉头蛋白c1(forkheadboxc1,foxc1)、跨膜及卷曲螺旋结构域1(transmembraneandcoiled-coildomains1,tmco1)、ph结构域a7(pleckstrinhomologydomaincontaininga7,plekha7)、视神经蛋白(optineurin,optn)和整合素亚基β5(integrinsubunitbeta5,itgb5)。在青光眼患者房水中，与这些mrnas表达的皮尔逊相关系数大于0.9并且错误发现率小于0.05的lncrnas有10种。实施例3我们利用qrt-pcr在青光眼及年龄相关白内障患者房水中验证实施例2中的10种lncrnas中，7种lncrnas在两类房水中的差异表达量具有统计学差异，3种lncrnas在两类房水中的差异表达量无统计学差异。然后选取具有统计学差异的lncrna:enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241进行进一步验证。实施例4我们运用qrt-pcr检测方法验证lncrna:enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241分子在房水中的表达水平，并分析其在青光眼患者和对照组人群中表达量的差异。4.1材料与试剂4.1.1主要仪器常用离心机及低温离心机购自eppendorf公司；高速离心机购自beckman公司；real-timepcr仪器购自abi公司；移液器和电动移液枪购自eppendorf公司；q5000购自quawelltechnology公司；制冰机购自sanyan公司。4.1.2材料与试剂不同型号的离心管及pcr管均购自axygen公司；depc水购自鼎国昌盛公司；trizol购自invitrogen公司；逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒均购自roche公司。4.1.3试剂配置各种免疫印迹所用试剂根据《分子克隆(第三版)》中提供的方法配置。4.2方法4.2.1房水样本准备房水样本按1.2.1所述步骤准备。4.2.2rna提取0.1毫升房水加入0.5毫升trizol试剂，剧烈震荡后加入0.1毫升氯仿。而后经离心、沉淀及75％乙醇清洗后溶于20微升dpec水，经q5000仪器测量各孔rna浓度。4.2.3qrt-pcr根据生厂商说明书首先依赖反转录酶将rna反转录成cdna，然后用pcr方法扩增cdna，通过测定荧光强度信号实时检测定量扩增的产物量。4.2.2数据分析采用spss19.0版统计学软件进行数据处理。计量资料以中位数±四分位数间距表示，青光眼/白内障代表两组中位数比值，比较进行mann-whitneyu检验。p值<0.05为差异有统计学意义。4.3结果为进一步扩大房水样本量验证相关lncrnas的表达水平并且探究特定lncrnas在青光眼患者房水中的表达量，我们利用qrt-pcr检测20个房水样本(10个青光眼患者房水样本，10个年龄与性别匹配的年龄相关性白内障患者房水标本)中enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241表达水平。结果表明，在两类房水样本中，enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241的表达量均有统计学差异，其在青光眼患者房水中表达量依次为在年龄相关性白内障患者房水中表达量的1.6200、1.9500、1.9302和1.8378倍(表1)(图4)。为进一步了解enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241在房水中诊断青光眼的有效性，我们利用所得数据绘制受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,roc)曲线(图5)。发现enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241在房水样本中诊断青光眼的roc曲线下面积分别为1.000、0.920、0.940和0.880。当enst00000564363、nr_026887、tcons_00025577和enst00000508241在房水中的诊断值设为0.0068、0.0056、0.0074和0.0048时，其诊断的敏感性/特异性依次为1.000/1.000、0.900/0.900、0.900/0.900和0.800/0.800(表2)。表1lncrnas在房水中的表达量lncrnas青光眼组白内障组青光眼/白内障p值enst000005643630.0081±0.00200.0050±0.00131.62000.001nr_0268870.0078±0.00210.0040±0.00151.95000.001tcons_000255770.0083±0.00500.0043±0.00181.93020.001enst000005082410.0068±0.00270.0037±0.00171.83780.004表2lncrnas在房水中诊断青光眼的敏感性和特异性sequencelisting<110>中南大学<120>青光眼诊断分子标记物lncrnasenst00000564363、试剂盒及应用<130>无<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>687<212>dna<213>lncrnaenst00000564363序列<400>1ttccaactacatgtctattttttattcaatatattaaatatattaatcagaaaagtcaca60tactataaatccaggaaaatacacaaatataaatgtcagaatctgtcatttgtcttcttc120ctagagtgacagtttatgtacatgtggaaggagggtaggaagagagagccagcaggaggc180tggaaaggctgcccaggaaggcggggcccatcccttcctcccagccccgctcccacctca240agctctttcttcctgtatttacagcagcactgggcttatttacagcacggcgctatgtgt300taaaaacggtttatcttacaaaaaacataaaggccggggccaggctgggggggataagac360aaatcgtggggtcacccccatgaaggcatccccctccccaagggcttgggggtgctctgg420gggtccgtggactaaaggcacatggggtggcatatgagagtgcgcatgtgcacacgtgtt480cccaggcaggggtcagaagggcagcgtgtccatgaagatcttgtcaatgatgggtggagg540gggcaccaagtcctccagcttgaggtagaagatgcgctgcaggccctgggtgcacagggt600ccgcagctcgggcagtttgcccaacagacgtgacaggcagctggctggctggggctcgcc660cgccacagctgccacgtgctccttcag687<210>2<211>21<212>dna<213>特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物序列f<400>2acaaaaaacataaaggccggg21<210>3<211>18<212>dna<213>特异性扩增lncrnasenst00000564363的引物序列r<400>3agagcacccccaagccct18当前第1页12