进行MTRR基因A66G多态性位点的分型检测方法与流程

本发明涉及基因检测技术领域，具体是进行mtrr基因a66g多态性位点的分型检测方法。

背景技术：

叶酸属于水溶性b族维生素，在核酸和蛋白质的生物合成中起重要的作用，是细胞增殖和机体发育的物质基础。中国是新生儿出生缺陷的高发国家之一，其中叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。机体叶酸缺乏主要有两方面原因：一是叶酸摄入不足，二是基因缺陷导致机体对叶酸利用效率低，即叶酸代谢障碍。

mtrr全称甲硫氨酸合成酶还原酶，它是维持甲硫氨酸合成酶活性的关键酶，甲硫氨酸合成酶在叶酸代谢与dna甲基化中起重要作用。甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲基氨酸合成酶。mtrr基因突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏的主要原因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要病因之一。其中，mtrr基因常见突变位点a66g突变，使甲硫氨酸被异亮氨酸替代，导致甲硫氨酸合成酶还原酶活性显著降低。因而mtrr基因缺陷的孕妇人群尤其需要补充叶酸，检测孕妇人群甲硫氨酸合成酶mtrr基因a66g突变位点，可为个体化补充叶酸，预防新生儿出生缺陷提供科学依据。

目前，基因多态性检测的方法主要有最常用的基因多态性检测方法为测序法，该方法优势是可以同时进行高通量多位点的检测，但其操作复杂耗时长且灵敏度低，容易出现样本间交叉污染且不能实现样本的快速检测；高分辨率溶解曲线法快速、简便、经济实用，但是它对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种重复性好、灵敏度高的进行mtrr基因a66g多态性位点的分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

进行mtrr基因a66g多态性位点的分型检测方法，是采用mtrr基因特异性的引物seq1和seq2扩增mtrr基因片段，同时在mtrr基因特异性的引物界定的扩增区域内设计mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位点为a则mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为a；若位点为g则mtrr基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述mtrr基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-tgaggaggtttctgttacta-3´；

所述mtrr基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-ctgcagaaaatccatgta-3´；

所述mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ccatcgcagaagaaatatgt-3´；

所述mtrr基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-ccatcgcagaagaaatgt-3´。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型的方法，采用mtrr特异性的基因扩增和taqman探针，本发明基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

附图说明

图1为本发明实施例中人mthfr-rs1801394位点aa基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图2为本发明实施例中人mthfr-rs1801394ag基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图3为本发明实施例中人mthfr-rs1801394位点gg基因型特异性片段扩增曲线示意图。

图4为本发明实施例中人mthfr-rs1801394位点的检测结果分布示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

请参阅图1-4，进行mtrr基因a66g多态性位点的分型检测方法，是采用mtrr基因特异性的引物seq1和seq2扩增mtrr基因片段，同时在mtrr基因特异性的引物界定的扩增区域内设计mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位点为a则mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a释放fam荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为a；若位点为g则mtrr基因特异性taqman探针seq4-vic-g释放vic荧光信号而被定量pcr仪器检测确认位点为g，最终通过fam/vic信号的比值来判断位点基因型；

所述mtrr基因特异性的引物seq1的核苷酸序列号如下：

5´-tgaggaggtttctgttacta-3´；

所述mtrr基因特异性的引物seq2的核苷酸序列号如下：

5´-ctgcagaaaatccatgta-3´；

所述mtrr基因特异性taqman探针seq3-fam-a的核苷酸序列号如下：

fam-5´-ccatcgcagaagaaatatgt-3´；

所述mtrr基因特异性taqman探针seq4-vic-g的核苷酸序列号如下：

vic-5´-ccatcgcagaagaaatgt-3´。

实施例：

（1）测试用正常人基因组dna制备：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制备，正常人基因组dna浓度稀释到10ng/μl。

（2）pcr特异性引物和探针设计合成：

根据人mtrr基因序列设计合成基因特异性引物seq1，seq2和mtrr特异性taqman基因探针标记seq3-fam-a和seq4-vic-g。

（3）mtrr定量pcr检测：

1）引物探针混合物配置：

2）反应体系：引物探针混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，标准模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr仪：abi7500。

4）反应条件：95℃、2min；95℃、15s——60℃、32s，42循环。

（4）基因验证结果读取：

参见图1，图1中横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，检测到vic、fam信号确定为扩增成功。根据样本fam/vic比值确定具体样本的基因型。

本发明是基于基因特异性pcr结合taqman探针判断基因snp位点分型的方法，采用mtrr特异性的基因扩增和taqman探针，本发明基于taqman探针定量pcr方法进行目的基因分型检测具有简便快捷，重复性高，灵敏度高，特异性好的特点。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。