一种检测茶叶中是否掺杂其它植物成分的方法与流程

本发明属于食品检测领域，具体涉及一种检测茶叶中是否掺杂其它植物成分的方法。

背景技术：

茶叶是中华民族家喻户晓的传统饮品，也是我国出口创汇的特色农产品。随着市场的开放和流通渠道的增多，茶叶消费市场以次充好、假冒伪劣甚至掺杂使假现象时有发生，给正常的茶叶消费和进出口贸易造成不良的影响。茶叶掺假方式多种多样，有以陈化、发霉变质的茶叶充当好茶，有以类似茶叶的其它树叶冒充茶叶，有的在真茶叶中掺入假、次茶叶，有的将饮用过又被晒干的茶叶重新销售等等。

目前茶叶掺假鉴别的检验方式主要是感官检验和理化检验。这些传统鉴别方式主要凭借业内人士的经验积累，普通消费者难以做到。随着科学技术的发展，分子生物学鉴定技术逐渐渗透到各个生物领域，但在茶叶掺杂检测领域的应用还很少见。本发明将常规分子生物学技术引入到茶叶掺杂的检验中，从茶叶中扩增植物dna条形码基因rbcl，然后进行克隆测序，这样使得茶叶掺杂的检测更加科学可靠。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种用于快速检测茶叶中是否掺杂其它植物成分的分子方法。

为达到上述目的，本发明提供的具体技术方案是：

一种检测茶叶中是否掺杂其它植物成分的方法，包括如下步骤：

(1)取茶叶提取总dna，然后通过两轮pcr扩增植物rbcl基因片段。第一轮扩增的条件：以提取的茶叶总dna为模板，引物为rbcla_f和724r；第二轮扩增的条件：取1μl第一轮扩增产物稀释50倍后的稀释液为模板，引物为rbcla_f和rbcla_r。

(2)将步骤(1)中第二轮扩增得到的扩增产物进化纯化，将纯化产物用于测序。通过观察测序图谱是否有套峰，判断检测的茶叶样品中是否掺杂了其它植物成分。

(3)将步骤(2)中经过纯化的扩增产物转化大肠杆菌，随机挑选8～10个阳性转化子进行测序。通过对测序得到的序列进行blast分析，确定待检测的茶叶样品中掺杂了哪种植物成分。

所述茶叶总dna提取的方法为ctab法或使用提取试剂盒。

所述pcr扩增使用的dna聚合酶为kodplus或easytaqpcrsupermix。

所述的测序为sanger法测序。

所述的blast分析的数据库为genbank或bold数据库。

上述技术方案中：

所述的茶叶可以为六大基本茶类，包括绿茶、白茶、黄茶、乌龙茶、黑茶和红茶，也可用于花茶、草药茶和其它再加工茶类。

第二轮pcr扩增使用的反向引物rbcla_r在rbcl基因中所处的位置比第一轮pcr扩增使用的反向引物724r更靠近上游。通过这种巢式pcr扩增可以提高扩增产物的产量。

与现有技术相比本发明具有下列优点：

(1)与传统的通过感官鉴别和理化分析进行茶叶掺杂检测的方法相比，本发明所述检测方法客观性更强，准确性更高，可以定性地知道茶叶中是否掺杂了其它植物成分，以及掺杂了什么植物成分。

(2)本发明所述检测方法适用于对各类茶叶中掺杂植物成分的快速检测。

(3)本发明所涉及的检测技术，如pcr扩增和大肠杆菌转化技术现在绝大多数学校或科研机构普遍都能完成。因此，本发明实施起来也很容易。

附图说明

图1.7份茶叶样品rbcl扩增结果的电泳图，其中z为红茶正山小种，h为岳阳黄茶，m为绿茶信阳毛尖，t为乌龙茶铁观音，l为白茶太老银针，b为六堡茶，p为宫廷普洱。mr为trans2kplusdnaladder。

图2.实施例1中pcr产物直接测序的测序图谱显示有测序套峰

图3.实施例2中pcr产物直接测序的测序图谱显示干净无套峰

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述：

实施例1：红茶正山小种的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取

称取0.13g茶叶于1.5mleppendorf管中，用手持式g50研磨器研磨茶叶后使用ctab法提取总dna。

2.rbcl基因片段的扩增与纯化

从提取的茶叶总dna中使用下面两种扩增体系之一扩增rbcl基因片段。其中，优选kodplusdna聚合酶扩增体系，easytaqpcrsupermix体系备用。

kodplusdna聚合酶体系(25μl)：

easytaqpcrsupermix体系(25μl)：

使用美国伯乐公司的t100pcr仪进行扩增。共需进行两轮pcr扩增。第一轮pcr扩增使用引物rbcla_f(5’-atgtcaccacaaacagagactaaagc)和724r(5’-tcgcatgtacctgcagtagc)；第二轮pcr扩增使用引物rbcla_f和rbcla_r(5’-gtaaaatcaagtccaccrcg)。第一轮扩增以提取的茶叶总dna为模板；第二轮扩增以第1轮扩增产物稀释50倍的稀释液为模板。

第一轮扩增程序：

从变性到延伸共40个循环，最后再在72℃延伸8min。

第二轮扩增程序：

从变性到延伸共40个循环，最后再在72℃延伸8min。

将第二轮扩增完成后的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(附图1)，在紫外灯下将目标条带切下后放入预先称重的eppendorf管中，使用omega公司的gelextractionkit通过切胶回收进行纯化。

3.rbcl基因片段的转化与测序

取4μl切胶纯化的dna片段与1μlpeasy-blunt3克隆载体混合后16℃过夜连接。连接产物全部用于大肠杆菌转化，通过蓝白斑筛选随机挑选约10个白斑克隆用载体引物m13f或pcr引物rbcla_f进行测序。同时，将切胶纯化的pcr产物用pcr引物rbcla_f进行直接测序。

4.测序结果的分析

通过finchtv软件观察pcr产物直接测序的测序峰图中是否有杂峰。对克隆测序获得的结果首先去掉载体序列，只保留真正rbcl片段的序列，最终获得的有效序列通过genbank和bold数据库进行blast分析，确定序列所代表的植物种类。

5.检验结果

正山小种扩增产物直接测序的峰图显示部分位置有杂峰(附图2)，但优势碱基为代表茶树的碱基。该直接测序结果进行blast分析，显示与茶树camelliasinensis的rbcl基因片段有最高的相似性。对扩增产物进行大肠杆菌转化后的9个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，3个克隆(z5、z7和z8)为茶树camelliasinensis的序列，2个克隆(z1和z3)为杨柳科柳属(salixspp.)植物的序列，2个克隆(z4和z10)为伞形花科(apiaceae)植物的序列，1个克隆(z2)为葫芦科的黄瓜(cucumissativus)，1个克隆(z6)为芸香科(rutaceae)植物的序列。因此，所检测的正山小种茶叶样品中掺杂了其它植物成分。

实施例2：岳阳黄茶的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

岳阳黄茶扩增产物直接测序的峰图非常干净，没有任何杂峰(附图3)。挑选扩增产物进行大肠杆菌转化后的8个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，8个克隆(h1-h5，h7-h9)全部为茶树camelliasinensis的序列。因此，所检测的岳阳黄茶样品中没有掺杂其它植物成分。

实施例3：绿茶信阳毛尖的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

信阳毛尖扩增产物直接测序的峰图非常干净，没有任何杂峰。挑选扩增产物进行大肠杆菌转化后的10个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，10个克隆(m1-m10)全部为茶树camelliasinensis的序列。因此，所检测的信阳毛尖茶叶样品中没有掺杂其它植物成分。

实施例4：乌龙茶铁观音的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

铁观音扩增产物直接测序的峰图显示部分位置有套峰，而且在这些位点两种峰的高度基本一样。对扩增产物进行大肠杆菌转化后的10个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，7个克隆(t2-t6、t8和t9)为茶树camelliasinensis的序列，1个克隆(t7)为芭蕉科芭蕉属(musaspp.)植物的序列，1个克隆(t10)为葫芦科的黄瓜(cucumissativus)，1个克隆(t1)为双子叶植物纲(magnoliopsida)某植物的序列(与公共数据库中的rbcl序列相似性最高只有97％，无法确认到更低的分类单元)。因此，所检测的铁观音茶叶样品中掺杂了其它植物成分。

实施例5：白茶太老银针的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

太老银针扩增产物直接测序的峰图显示部分位置有杂峰，但优势碱基为代表茶树的碱基。该直接测序结果进行blast分析，显示与茶树camelliasinensis的rbcl基因片段有最高的相似性。对扩增产物进行大肠杆菌转化后的10个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，3个克隆(l4、l7和l10)为茶树camelliasinensis的序列，2个克隆(l1和l3)为茶科茶属(camelliaspp.)植物的序列(其与茶树camelliasinensis的序列相似性最高约98％，无法确切判断是否茶树)，1个克隆(l8)为芭蕉科芭蕉属(musaspp.)植物的序列，1个克隆(l2)为伞形花科(apiaceae)植物的序列，1个克隆(l9)为五福花科荚莲属(viburnumspp.)植物的序列(与公共数据库中的rbcl序列相似性最高约96％)，1个克隆(l5)可能为金虎尾科(malpighiaceae)植物的序列(与公共数据库中的rbcl序列相似性最高约95.5％)，1个克隆(l6)为双子叶植物门(magnoliophyta)植物的序列(与公共数据库中的rbcl序列相似性最高约94％)。因此，所检测的太老银针茶叶样品中掺杂了其它植物成分。

实施例6：黑茶六堡茶的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

六堡茶扩增产物直接测序的峰图显示部分位置有套峰。对扩增产物进行大肠杆菌转化后的10个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，2个克隆(b3和b4)为茶树camelliasinensis的序列，2个克隆(b7和b9)为伞形花科(apiaceae)植物的序列，2个克隆(b2和b8)为豆科(fabaceae)植物的序列，2个克隆(b1和b5)为葫芦科(cucurbitaceae)植物的序列，2个克隆(b6和b10)为双子叶植物纲(magnoliopsida)某植物的序列(与公共数据库中的rbcl序列相似性最高只有96.5％)。因此，所检测的六堡茶茶叶样品中掺杂了其它植物成分。

实施例7：黑茶宫廷普洱的掺杂检验

1.茶叶总dna的提取，见实施例1中的描述。

2.rbcl基因片段的扩增与切胶回收，见实施例1中的描述。

3.rbcl基因片段的转化与测序，见实施例1中的描述。

4.测序结果的分析，见实施例1中的描述。

5.检验结果

宫廷普洱扩增产物直接测序的峰图显示部分位置有套峰。对扩增产物进行大肠杆菌转化后的10个阳性克隆进行测序，序列blast分析结果显示，3个克隆(p6，p8和b10)为茶树camelliasinensis的序列，2个克隆(p1和p7)为胡麻科芝麻sesamumindicum的序列，2个克隆(p2和p3)为唇形目(lamiales)植物的序列，1个克隆(p4)为伞形花科(apiaceae)植物的序列，1个克隆(p5)为蔷薇科(rosaceae)植物的序列，1个克隆(p9)为芭蕉科芭蕉属(musaspp.)植物的序列。因此，所检测的宫廷普洱茶叶样品中掺杂了其它植物成分。