与非洲稻籽粒长度相关的SNP位点及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种与非洲稻籽粒长度相关的snp位点及其应用。

背景技术：

稻属(oryzal.)植物包含两个极为重要的栽培作物，即亚洲栽培稻(o.satival.)和非洲栽培稻(oryzaglaberrimasteud.)，分别独立起源于亚洲和非洲。

非洲栽培稻是大约3000年前独立起源于非洲的栽培稻，和亚洲栽培稻是由不同的祖先物种驯化而来。16世纪中叶，葡萄牙人便将亚洲栽培稻引入西非，导致非洲栽培稻的物种迅速减少，所以现在的种植区域和面积远小于亚洲栽培稻。目前，亚洲栽培稻已在全球范围内广泛种植，为世界上近一半人口提供食物来源。非洲栽培稻局限分布于非洲的西部，是当地主要的粮食作物之一，对非洲的文明和当地经济起到了积极的作用。然而，与开展了广泛研究的亚洲栽培稻相比，非洲栽培稻的相关研究十分匮乏，迄今对非洲栽培稻的群体遗传结构和进化历史知之甚少。

但是，非洲栽培稻具有早熟、抗病、耐干旱等特性，在特殊生态环境中有一定的生产优势。因此，筛选高产非洲栽培稻具有一定的应用价值。

技术实现要素：

本发明公开了一种与非洲稻籽粒长度相关的snp位点及其应用。

本发明所提供的应用具体为非洲稻基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性或用于检测非洲稻基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度中的应用；

所述snp位点在非洲稻基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第64位；所述snp位点处的核苷酸为c或t。

其中，所述“用于检测非洲稻基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质”具体可为如下所述的引物对或试剂盒。

本发明保护用于鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度的引物对和试剂盒。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度的引物对，为能够以非洲稻基因组dna为模板扩增得到具有序列表中序列1所示核苷酸序列的dna片段的引物对。

进一步，所述dna片段为以非洲稻基因组dna为模板，采用由序列表中序列2和序列3所示的两条单链dna组成的引物对进行pcr扩增所得的dna片段。

更加具体的，所述引物对为由序列表中序列2和序列3所示的两条单链dna组成的引物对。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度的试剂盒，含有所述引物对、dntp以及dna聚合酶。

所述引物对或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测非洲稻的籽粒长度的方法，具体可包括如下步骤：检测待测非洲稻的基因组中如下snp位点处的核苷酸，确定所述待测非洲稻的基因型，根据所述待测非洲稻的基因型按照如下确定所述待测非洲稻的籽粒长度：c:c基因型的待测非洲稻的籽粒长度大于或候选大于t:t基因型的待测非洲稻的籽粒长度。

所述snp位点在非洲稻基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第64位；所述snp位点处的核苷酸为c或t；

所述c:c基因型为非洲稻基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第64位为c的纯合型；

所述t:t基因型为非洲稻基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第64位为t的纯合型。

其中，所述“检测待测非洲稻的基因组中如下snp位点处的核苷酸”的方法具体可包括如下两个步骤：

(1)以所述待测非洲稻的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，得到pcr产物；

(2)对所述pcr产物进行测序从而确定所述snp位点处的核苷酸。

所述引物对或所述试剂盒或所述方法在非洲稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。

其中，所述非洲稻育种具体为提高非洲稻收获产量的育种。所述应用中，可选择所述c:c基因型的非洲稻作为亲本进行育种，或者选择具有c:c基因型的育成品种。

在本发明的一个实施例中，所述待测非洲稻具体为表1中所示的非洲稻品种。在本发明的另一个实施例中，所述待测非洲稻具体为非洲稻品种pi450352和pi450489的杂交后代(如f2代)。

实验证明，本发明在非洲栽培稻中发现的位于gl4基因的c766t这个snp位点与非洲稻籽粒长度密切相关。该位点为c纯合型的非洲稻其籽粒长度明显大于该位点为t纯合型的非洲稻。本发明对于筛选和培育高收获产量非洲稻新品种具有重要意义。

附图说明

图1为株系gil25与非洲稻品种irgc102305的籽粒长度比较。

图2为gl4基因定位示意图。

图3为转入pgl4-2载体的转基因株系的pcr鉴定结果。

图4为转入pgl4-2载体的转基因株系与非洲稻品种irgc102305的籽粒长度比较。图中，pgl4-2表示转入pgl4-2载体的转基因株系。

图5为转目的基因植株籽粒大小与转空载植株籽粒大小以及受体材料籽粒大小的比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pcambia1300载体：记载于“zhuzuofeng,tanlubin,fuyongcai,liufengxia,caihongwei,xiedaoxin,wufeng,wujianzhong,matsumototakashi,sunchuanqing.geneticcontrolofinflorescencearchitectureduringricedomestication.naturecommun,2013,4:2200doi:10.1038/ncomms3200.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

非洲稻品种irgc102305、非洲野生稻w1411和表1中非洲稻品种：其中“pi”编号开头的非洲栽培稻可以从美国农业部获得，网址为：http://www.ars-grin.gov/npgs/pi_books/scans/pi188pt2.pdf；或者https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/search.aspx？；其他编号可以从国际水稻研究所获得，网址为：为：http://www.irgcis.irri.org:81/grc/irgcishome.html；或者https://shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/strain/wildcore/list。

实施例1、调控非洲稻籽粒大小基因的定位及snp位点的确定

一、调控非洲稻籽粒大小基因的定位

非洲稻品种irgc102305与非洲野生稻w1411杂交，再将irgc102305作为轮回亲本，多次回交获得一个在籽粒大小上与irgc102305差别明显的株系gil25(图1)，将其与irgc102305杂交构建了一个包含186个单株的f2分离群体。在这个f2群体中，籽粒长度与标记rm3335与rm5608紧密连锁，且将gl4基因定位在这两个基因之间。然后将分离群体扩大到6500个单株，并根据标记rm3335与rm5608之间的序列设计引物，最终将gl4基因定位到标记m3与m4之间的5.9kb上(图2)。在网站http://ensembl.gramene.org/oryza_glaberrima上根据非洲栽培稻irgc96717(cg14)序列预测，该区间只含有一个候选基因orgla04g0254300。因此该基因就是gl4基因，控制非洲栽培稻的籽粒长度。株系gil25与非洲野生稻w1411的gl4基因序列相同。

非洲野生稻w1411的gl4基因序列如序列表中序列4所示。非洲稻品种irgc102305的gl4基因序列如序列表中序列5所示。对非洲野生稻w1411和非洲栽培稻品种irgc102305的gl4基因的编码区序列比对发现，一共有五处变异：g294a，c766t，c1466t，a1515g和gccgcc681-686缺失(变异是非洲栽培稻品种irgc102305相对于非洲野生稻w1411而言的)。通过16份野生稻和67份非洲栽培稻的gl4基因序列比对发现，c766t与籽粒长度关联程度最高。具体试验方案如下：

一、表达载体的构建

以非洲栽培稻品种irgc102305的基因组为模板，设计如下两个引物对pgl4-2af/pgl4-2ar和pgl4-2bf/pgl4-2br，其中带下划线且为粗体的碱基为人为引入，为的是回复c766t突变，斜体且带下划线部分为pcambia1300载体序列。

pgl4-2af：5’-gctggccgtagaagtcaag-3’；

pgl4-2ar：5’-cgacgacggcggcggctaggaggaggtgggtggtg-3’。

pgl4-2bf：5’-agccgccgccgtcgtcgctgca-3’；

pgl4-2br：5’-gtatagctcagcacgagc-3’。

以非洲栽培稻品种irgc102305的基因组为模板，分别以引物对pgl4-2af/pgl4-2ar和pgl4-2bf/pgl4-2br进行扩增，分别获得长度约为3.1kb和1.8kb的片段，切胶回收后，通过同源重组酶将这两个片段与pcambia1300载体相连接，获得一个包含gl4上游2kb以及下游560bp的重组载体，测序正确后命名为pgl4-2。pgl4-2载体所嵌入的片段除上述c766t位置与非洲栽培稻irgc102305不同外，其他序列与irgc102305完全相同。在c766t位置，载体pgl4-2为碱基c，而非洲栽培稻品种irgc102305为碱基t。

pgl4-2载体的结构描述为：将序列表中序列6所示dna片段与pcambia1300载体同源重组(上下游同源臂分别为序列6的第1-18位和第4906-4931位)后所得的重组载体。

其中，序列6的第1-18位和4906-4931位为pcambia1300载体上的序列，第19-2340位为非洲栽培稻品种irgc102305内源的gl4基因启动子序列，第2341-4346位为gl4基因(第3169-4007位为内含子序列)。

二、转化非洲栽培稻及pcr鉴定

将步骤一构建的载体pgl4-2通过基因枪法转化进籽粒较短且不落粒的非洲栽培稻品种irgc102305，用含潮霉素的nb培养基进行2轮筛选，再经与分化，分化得到转基因植株。实验同时设置向非洲栽培稻品种irgc102305中转入pcambia1300空载体的对照。

通过pcr鉴定转基因植株。具体操作如下：取生长期转化植株以及空载体对照植株和非洲栽培稻品种irgc102305的叶片，使用ctab法提取总dna，使用如下引物针对pcambia1300载体上自带的潮霉素抗性基因进行pcr鉴定：

hptf：5’-gtctccgacctgatgcagctctcgg-3’；

hptr：5’-gtccgtcaggacattgttggag-3’。

鉴定结果如图3所示，泳道1为dnamarkeriii(北京拓英坊科技有限公司产品)，目的条带大小为520bp。泳道2-15为转基因阳性植株，泳道16为双蒸水，泳道17为未转基因的非洲栽培稻品种irgc102305，泳道18为阳性对照pcambia1300载体。

三、转基因稻的功能鉴定

经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定共获得15株转基因植株。以这15株转基因植株，以及转入pcambia1300空载体的对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305为实验材料。观察各实验材料的籽粒表型，并统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，每个系10株。

结果显示：

与空载对照和未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305相比，经步骤二潮霉素抗性筛选及pcr鉴定共获得15株转基因植株其籽粒全部为较长籽粒(图4)。

统计3个转基因株系、3个空载对照株系和非洲栽培稻品种irgc102305的籽粒长度，结果如图5所示。其中，pgl4-2-1、pgl4-2-2和pgl4-2-3表示随机选取的3个转基因株系，vector-1、vector-2和vector-3表示随机选取的3个空载对照株系，irgc102305-1表示未经转基因处理的非洲栽培稻品种irgc102305。由图可见，非洲栽培稻irgc102305的籽粒长度为8.25厘米，转入空载体的阳性单株籽粒长度为8.21-8.27厘米，转入pgl4-2载体的阳性单株籽粒长度为9.24-9.28厘米。转入pgl4-2的阳性单株籽粒长度相对于转入空载的阳性单株和受体材料irgc102305都有明显提高(t测验，p<0.05)。因此，c766t是能够使非洲栽培稻籽粒长度增加的snp。该snp位点可描述为在非洲稻基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第64位；所述snp位点处的核苷酸为c或t。

实施例2、snp位点c766t在鉴定现有非洲稻品种籽粒长度上的应用

一、实验材料

利用来源分布于非洲西部多个国家的67个非洲稻品种为实验材料(具体见表1)，鉴定snp位点c766t在非洲稻籽粒长度选择上的应用。

二、实验方法

将各供试植株苗期单株挂牌取样后，提取其基因组dna并以其为模板，用引物f和引物r进行pcr扩增，得到pcr产物后进行测序，根据测序结果按照如下方法确定待测单株的基因型：若所得pcr产物中含有序列1所示核苷酸序列，且序列1的第64位为c纯合型，则该待测单株为c:c基因型；若所得pcr产物中含有序列1所示核苷酸序列，且序列1的第64位为t纯合型，则该待测单株为t:t基因型。

f：5’-aagcctctcgtcgcgcagca-3’(序列2)；

r：5’-gagctcagctcgctgcgaggt-3’(序列3)。

同时，待非洲稻成熟后，考查并统计各单株的籽粒长度。

三、实验结果

结果如表1所示，可见：一共5个c:c基因型的非洲栽培稻中，有4个籽粒长度大于8.5厘米，62个t:t基因型的非洲栽培稻中，有47个籽粒长度小于8.5厘米。80％的c:c基因型非洲栽培稻籽粒长度大于8.5厘米，75.8％的t:t基因型的非洲栽培稻籽粒长度小于8.5厘米。该结果表明c:c基因型的非洲稻其籽粒长度明显大于t:t基因型的非洲稻。

表167个非洲栽培稻品种籽粒长度和c766t的基因型

实施例3、snp位点c766t在鉴定非洲稻亲本杂交后代籽粒长度上的应用

一、实验材料

利用表1中的pi450352(父本，c:c基因型)和pi450489(母本，t:t基因型)杂交的f2代为实验材料，鉴定snp位点c766t在非洲稻籽粒长度选择上的应用。同时设置两亲本对照。

二、实验方法

将各供试植株苗期单株挂牌取样后，提取其基因组dna并以其为模板，用引物f和引物r(序列2和序列3)进行pcr扩增，得到pcr产物后进行测序，根据测序结果按照如下方法确定待测单株的基因型：若所得pcr产物中含有序列1所示核苷酸序列，且序列1的第64位为c纯合型，则该待测单株为c:c基因型；若所得pcr产物中含有序列1所示核苷酸序列，且序列1的第64位为t纯合型，则该待测单株为t:t基因型；若所得pcr产物中含有序列1所示核苷酸序列，且序列1的第64位为c和t杂合型，则该待测单株为c:t基因型。

同时，待非洲稻成熟后，考查并统计各单株的籽粒长度。

三、实验结果

结果表明，c:c基因型的父本pi450352籽粒长度均值为8.88厘米，t:t基因型的母本pi450489籽粒长度均值为7.78厘米。f2中，一共有47株为c:c基因型，其籽粒平均长度为8.87厘米，103株为c:t基因型，其籽粒平均长度为8.41厘米，52株为t:t基因型，其籽粒平均长度为7.82厘米。该结果表明c:c基因型的非洲稻杂交后代籽粒长度明显大于t:t基因型的非洲稻杂交后代，在选育品种时，c760t位点可以作为分子辅助选择的标记。

<110>中国农业大学

<120>与非洲稻籽粒长度相关的snp位点及其应用

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<160>6

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<213>非洲野生稻（oryzabarthiil.）

<400>4

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<213>非洲栽培稻（oryzaglaberrimal.）

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