ZmPGK基因在玉米矮花叶病防治中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术及作物病害防治技术领域，具体地说，涉及zmpgk基因在玉米矮花叶病防治中的应用。

背景技术：

玉米是我国主要粮食作物，但由甘蔗花叶病毒(sugarcanemosaicvirus，scmv)侵染引起的玉米矮花叶病(maizedwarfmosaicdisease,mdmd)对我国玉米高产、稳产造成严重威胁。scmv是造成我国北方玉米产区玉米矮花叶病的主要病原，常引起玉米30％以上的产量损失。由于scmv强致病力株系的出现，一些原有的抗病毒品种丧失抗性，在生产上导致更大的危害。亟需鉴定新的抗病基因或抗性材料，以便可持续、更有效地控制scmv及其危害，保证玉米生产安全。

植物病毒作为一种细胞内专性寄生物，在侵染、增殖过程中必须依赖和借助寄主因子完成病毒脱壳、基因组复制、蛋白表达、病毒颗粒组装和向邻近细胞移动等生命过程。因此，鉴定参与植物病毒侵染、增殖过程中的寄主因子能够帮助我们深入了解病毒的侵染和致病机制，从而为病毒病的防控提供新的材料和理论基础。后基因组时代，各种组学技术被广泛地应用于寄主与生物胁迫或非生物胁迫互作研究，并已成为探寻病毒致病机制及寻找抗病基因的主要手段之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供zmpgk基因在玉米矮花叶病防治中的应用。

本发明的另一目的是提供一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制和增殖的方法。

本发明利用同位素标记相对和绝对定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白组学技术，筛选scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系统侵染叶片中显著差异表达的蛋白，鉴定到一个在两片叶片中均显著差异表达的蛋白zmpgk。

为了实现本发明目的，本发明提供zmpgk基因在玉米矮花叶病防治中的应用，其是利用基因工程的方法，通过抑制zmpgk基因在玉米中的表达，从而提高作物对玉米矮花叶病的抗病性。

本发明所述玉米矮花叶病是指由scmv侵染引起的玉米矮花叶病害。

本发明中，zmpgk基因来自玉米，所述zmpgk基因为：

i)seqidno:2所示的核苷酸序列；或

ii)seqidno:2第234-1439位所示的核苷酸序列；或

iii)seqidno:2第234-1442位所示的核苷酸序列；或

iv)在严格条件下与i)～iii)任一序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

v)与i)～iii)任一序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

由所述zmpgk基因编码的蛋白为：

a)seqidno:1所示的氨基酸序列；或

b)seqidno:1所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

前述应用包括向玉米中导入用于抑制所述zmpgk基因表达的物质。

本发明中，所述用于抑制zmpgk基因表达的物质包括但不限于shrna、sirna、dsrna、mirna、cdna、反义rna/dna。

优选地，所述用于抑制zmpgk基因表达的物质是由seqidno:2第990-1200位所示的核苷酸序列编码的rna。

更优选地，所述用于抑制zmpgk基因表达的物质是携带有由seqidno:2第990-1200位所示核苷酸序列编码的rna的重组雀麦花叶病毒。

当用于抑制所述zmpgk基因表达的物质为核酸分子时，含有编码所述核酸分子的dna片段的载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

携带有所述目的片段的表达载体可通过使用ti质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(weissbach，1998，methodforplantmolecularbiologyviii，academypress，newyork，第411-463页；geiserson和corey，1998，plantmolecularbiology，2^ndedition)。

本发明还提供一种抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制和增殖的方法，其是向玉米中导入用于抑制zmpgk基因表达的物质，从而抑制甘蔗花叶病毒在玉米中的复制和增殖。

本发明还提供一种用于防治玉米矮花叶病的药剂或组合物，其活性成分为抑制zmpgk基因表达的物质。

本发明进一步提供一种用于抑制甘蔗花叶病毒在玉米中复制和增殖的药剂或组合物，其活性成分为抑制zmpgk基因表达的物质。

在本发明的一个优选实施方式中，抑制zmpgk基因在玉米中表达的具体方法如下：

1、提取玉米自交系va35的总rna并反转录为cdna。

2、以步骤1得到的cdna为模板，用zmpgk-silencing-f和zmpgk-silencing-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

zmpgk-silencing-f：5'-gacctaggtctcttattgagaaggc-3'

zmpgk-silencing-r：5'-tcccatggggccgttccaaat-3'

3、用限制性内切酶ncoi和avrii酶切步骤2的pcr扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶ncoi和avrii酶切载体pc13/f3-13m，回收约5000bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pc13/f3-13m-pgk。

6、将重组载体pc13/f3-13m-pgk和载体pc13/f1+2共转染本生烟叶片，培养后得到含有重组雀麦花叶病毒(bromemosaicvirus,bmv)的病毒粒子的叶片。

7、从步骤6的烟草叶片中提纯重组bmv病毒粒子。

8、在两叶期，选取生长良好的且第2片叶(第一片真叶)基本完全展开的va35玉米苗，在第2片叶上撒上少许金刚砂，用提纯的重组bmv病毒粒子进行摩擦接种，进而瞬时沉默zmpgk基因。

在玉米叶片中瞬时沉默zmpgk基因后接种scmv，虽然其发病时间与在未沉默zmpgk基因的玉米叶片上接种scmv的发病时间和侵染症状无明显差异，但沉默zmpgk基因后显著抑制了scmv的积累(表现在scmv基因组rna水平和cp的蛋白水平均显著降低)。由此推测，zmpgk可能是scmv侵染过程中必要的寄主因子，在侵染过程中被病毒招募，参与scmv复制增殖过程，是玉米编码的抗scmv的隐性抗病毒基因。zmpgk基因可能在防治由scmv引起的玉米矮花叶病害中发挥重要作用。

本发明首次通过基因功能试验和验证，沉默zmpgk基因导致了scmv复制和增殖水平显著降低，表明玉米蛋白zmpgk及其编码基因在scmv侵染、增殖中发挥重要作用，是玉米编码的抗scmv的隐性抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育种等工作。本发明将为研究植物蛋白在病毒侵染中的作用，玉米抗病毒育种等领域提供依据，提高我国玉米抗病毒研究水平，促进和保证我国玉米生产安全。

附图说明

图1为本发明实施例3中scmv在沉默zmpgk玉米植株上的侵染表型；其中，bmv-pgk为zmpgk基因沉默植株，bmv-gfp为对照。

图2为本发明实施例3中沉默zmpgk基因抑制了scmv在玉米植株中的复制和增殖；其中，(a)scmv接种后7天和14天，zmpgk在对照组(bmv-gfp)和处理组(bmv-pgk)系统侵染的叶片中相对积累量；(b)scmv基因组rna相对积累量；(c)scmvcp相对积累量；(d)利用imagej软件对scmvcp相对积累量统计分析结果。

图2(c)中cbb表示考马斯亮蓝染色；将对照组的积累量设定为1，0.676和0.768分别表示处理组中蛋白相对于对照组的积累量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明中使用的生物材料如下：

玉米自交系va35：参见dingxs,schneiderwl,chaluvadisr,etal.characterizationofabromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts.molplant-microbeinteract,2006,19:1229-1239.

本生烟：参见goodinmm,zaitlind,naiduraetal.nicotianabenthamiana:itshistoryandfutureasamodelforplant-pathogeninteractions.molplant-microbeinteract,2008,21(8):1015-1026。

载体pc13/f1+2：参见zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

载体pc13/f3-13m-gfp：参见zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

载体pc13/f3-13m：参见zhum,cheny,dingxs,etal.maizeelongincinteractswiththeviralgenome-linkedprotein,vpg,ofsugarcanemosaicvirusandfacilitatesvirusinfection.newphytologist,2014,203:1291-1304.

载体pc13/f1+2和载体pc13/f3-13m共转染烟草后，表达雀麦花叶病毒(bmv)的病毒粒子。雀麦花叶病毒的病毒粒子由三条rna链组成,载体pc13/f1+2含有rna1和rna2，载体pc13/f3-13m含有rna3，二个载体共转染烟草后扩繁bmv的重组病毒粒子。

甘蔗花叶病毒(scmv)：参见fanzf,chenhy,liangxm,etal.completesequenceofthegenomicrnaoftheprevalentstrainofapotyvirusinfectingmaizeinchina.archvirol,2003,148:773-782。

实施例1zmpgk蛋白及其编码基因的发现

利用同位素标记相对和绝对定量(isobarictaggingforrelativeandabsolutequantification,itraq)蛋白组学技术和方法，筛选scmv侵染玉米后上部第一片和第二片系统侵染叶片中显著差异表达的蛋白，鉴定到一个在两片叶片中均显著差异表达的蛋白zmpgk，序列如seqidno:1所示。将编码zmpgk蛋白的基因命名为zmpgk基因，序列如seqidno:2所示。

实施例2构建重组质粒pc13/f3-13m-pgk

1、提取玉米自交系va35的总rna并反转录为cdna。

2、以步骤1得到的cdna为模板，用zmpgk-silencing-f和zmpgk-silencing-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

zmpgk-silencing-f：5'-gacctaggtctcttattgagaaggc-3'

zmpgk-silencing-r：5'-tcccatggggccgttccaaat-3'

3、用限制性内切酶ncoi和avrii酶切步骤2的pcr扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶ncoi和avrii酶切载体pc13/f3-13m，回收约5000bp的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组载体pc13/f3-13m-pgk。根据测序结果，对重组载体pc13/f3-13m-pgk进行结构描述如下：在载体pc13/f3-13m的ncoi和avrii酶切位点插入了seqidno:2第990-1200位所示的双链dna分子。

zmpgk基因的瞬时沉默载体由重组载体pc13/f3-13m-pgk、载体pc13/f1+2组成。

实施例3zmpgk基因的瞬时沉默实验

一、在本生烟中扩繁bmv的病毒粒子

1、用携带bmv载体的农杆菌浸润本生烟

(1)将测序正确的pc13/f3-13m-pgk载体转化到农杆菌c58c1感受态细胞中；同时将-80℃保存的携带pc13/f1+2和pc13/f3-13m-gfp的农杆菌菌种于lb平板(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)上划线，28℃培养48h左右。挑取lb平板上的单菌落接种于3～4ml的lb液体培养基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培养14～18h；

(2)按1:100的比例取200～300μl的菌液转接于20～30mllb液体培养基(含50μg/mlkan，100μg/mlrif)中，28℃，180rpm培养10～12h；

(3)室温，4500rpm离心8min收集菌体，用20ml浸润缓冲液(10mmmes，ph5.7，10mmmgcl2，200μm乙酰丁香酮)悬浮沉淀，用分光光度计测定菌悬液的浓度，用浸润缓冲液调整菌悬液浓度至最终浓度为od600＝2.0。

(4)将携带pc13/f1+2的菌悬液分别和等体积的携带pc13/f3-13m-pgk与pc13/f3-13m-gfp的菌悬液混匀后，室温放置3h。用无针头的1ml注射器浸润本生烟叶片的下表皮。

(5)浸润后的本生烟置于22～24℃的人工气候室中培养3天后取样，取样时将样品用锡箔纸包好迅速置于液氮中冷冻，置-80℃保存备用。

2、zmpgk插入片段的检测

取0.1g左右的农杆菌浸润的本生烟叶片，用trizol法提取烟草叶片的总rna，用oligodt(5'-tttttttttttttttttt-3')引物进行反转录，以反转录产物cdna为模板用引物xsd198/199(xsd198：5'-cttgtgttgctgagaaac-3'；xsd199：5'-tcttgtaagaggtctgc-3')进行pcr扩增，并对pcr产物进行电泳分析，用pc13/f3-13m空载体质粒为对照，检测农杆菌浸润的本生烟叶片中重组bmv病毒携带的外源插入片段是否发生丢失。将携带完整外源插入片段的bmv重组病毒的烟草叶片，在液氮中研磨，磨成粉末后分装到2ml离心管中(每管0.4g左右)，-80℃保存备用。

3、bmv病毒粒子的粗提纯

(1)取适量(根据需接种的玉米植株数量而定)的-80℃保存的烟草叶片样品粉末，每管中加入800μlbmv提取缓冲液，混匀后置冰上孵育20～30min；

(2)4℃，8000g离心10min，取上清，按照每200μl上清液加入46μl40％peg/nacl溶液的比例加入相应体积的40％peg/nacl溶液，充分混匀后置于冰上，在摇床上低转速孵育1h；

(3)4℃，13000g离心15min，弃上清，每管用100μlbmv储存缓冲液悬浮沉淀，即得到粗提纯的bmv病毒粒子，用于后续的摩擦接种实验。

4、病毒粒子接种va35玉米和挑战接种scmv

用nanodrop^tm分光光度计检测bmv病毒粒子的浓度，od260的值约等于病毒粒子的浓度(μg/μl)。在两叶期，选取生长良好的且第2片叶(第一片真叶)基本完全展开的va35玉米苗，在第2片叶上撒上少许金刚砂，每棵用20μg粗提纯的bmv病毒粒子进行摩擦接种。bmv-pgk与bmv-gfp(作为对照)接种相同数量的植株。将接种后的玉米植株置于透光的塑料罩内，在18～20℃光照培养箱内培养6天后移去塑料罩，在第二片叶(第一片真叶)挑战接种scmv，并将接种后的植物置于24℃/22℃光照培养箱或人工气候室中继续培养，分别于scmv接种后7天和14天检测目标基因的沉默效率和对应的scmvrna和cp(外壳蛋白)的积累量。

二、瞬时沉默zmpgk基因降低了scmv复制和积累水平

1、病毒粒子接种va35玉米和挑战接种scmv

用nanodrop^tm分光光度计检测bmv病毒粒子的浓度，od260的值约等于病毒粒子的浓度(μg/μl)。在两叶期，选取生长良好的且第2片叶(第一片真叶)基本完全展开的va35玉米苗，在第2片叶上撒上少许金刚砂，每棵用20μg粗提纯的bmv病毒粒子进行摩擦接种。bmv-pgk与bmv-gfp(作为对照)接种相同数量的植株。将接种后的玉米植株置于透光的塑料罩内，在18～20℃光照培养箱内培养6天后移去塑料罩，在第二片叶(第一片真叶)挑战接种scmv，并将接种后的植物置于24℃/22℃光照培养箱或人工气候室中继续培养，分别于scmv接种后7天和14天检测目标基因的沉默效率和对应的scmvrna和cp的积累量。

2、scmv接种后第7天和第14天，取上部第二片系统侵染叶片，提取总rna并反转录为cdna，以cdna作为模板，采用康为世纪荧光定量pcr试剂和，采用ubiquitin基因作为内参基因，rt-qpcr鉴定zmpgk基因的相对表达量和scmv基因组rna的含量，采用ubiquitin基因作为内参基因。

用于鉴定zmpgk基因的引物对如下：

zmpgk-qrt-f：5'-aaggctaaggtttactcctccaca-3'

zmpgk-qrt-r：5'-aattccagtcacttcacccaca-3'

用于鉴定ubiquitin基因的引物对如下：

ubi-qrt-f：5'-ggaaaaaccataaccctgga-3'

ubi-qrt-r：5'-atatggagagagggcaccag-3'

用于鉴定scmv的引物对如下：

scmv-cp-qrt-f：5'-ggcgagactcaggagaataca-3'

scmv-cp-qrt-r：5'-acacgctacaccagaagacact-3'

得到的数据用2^-△△ct法进行分析，步骤如下：

首先，对实验组样本(test)和对照组样本(calibrator)，用参照基因(ref)的ct值归一目标基因(target)的ct值：

△ct(test)＝ct(target,test)-ct(ref,test)

△ct(calibrator)＝ct(target,calibrator)-ct(ref,calibrator)

其次，用对照组样本的△ct值归一实验组样本的△ct值：

△△ct＝△ct(test)－△ct(calibrator)

最后，计算表达水平比率：

2^-△△ct＝表达量的比值

scmv基因组rna的相对含量见图2(b)，zmpgk基因的相对表达量见图2(a)。

结果表明，scmv接种后第7天和第14天，与对照组相比，实验组zmpgk积累量分别下降了约60％和65％左右，scmv基因组rna的积累量均为对照组的60％左右。scmvcp的积累量分别为对照组的0.7和0.8倍。

5、scmv接种后第7天和第14天，取上部第二片系统侵染叶片，提取总蛋白，以scmvcp抗血清为一抗，ap标记的羊抗兔为二抗，进行westernblot分析，见图2(c)和图2(d)。结果表明，结果表明，在zmpgk沉默效率分别约为60％和65％的植株上，scmvcp的积累量明显减少，仅为对照组的0.7倍和0.8倍。

以上结果表明，在玉米叶片中瞬时沉默zmpgk基因后接种scmv，虽然其发病时间与在未沉默zmpgk基因的玉米叶片上接种scmv的发病时间和侵染症状无明显差异(图1)，但沉默zmpgk基因导致了scmv复制和增殖水平显著降低(图2)，表明玉米蛋白zmpgk及其编码基因在scmv侵染、增殖中发挥重要作用，是玉米编码的抗scmv的隐性抗病毒基因，可以用于玉米抗scmv的分子育种等工作。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国农业大学

<120>zmpgk基因在玉米矮花叶病防治中的应用

<130>khp171112947.3

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>402

<212>prt

<213>玉米

<400>1

metalathrlysargservalglythrleuglyglualaaspleulys

151015

glylyslysvalphevalargalaaspleuasnvalproleuaspasp

202530

alaglnlysilethraspaspthrargileargalaservalprothr

354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

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195200205

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210215220

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225230235240

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245250255

lysalalysalalysglyvalserleuleuleuprothraspileval

260265270

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275280285

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290295300

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<213>玉米

<400>2

ccgtccattcgatcgcctcacccgaagcacatcccgtcgcatcccatcccactaccaccc60

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gtggtggtatgatctacacattttacaaggcacagggatattctgttggaaaatctctcg960

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ggatc1985