小麦穗密度QTL连锁的HRM分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学以及作物遗传育种，特别是涉及小麦的穗密度性状相关的分子标记，具体地说是涉及了小麦的穗密度qtl位点qsd.sau-7a连锁的hrm标记，以及该标记的应用。
背景技术：
：小麦(triticumaestivuml.)是世界上最重要的粮食作物之一，目前世界可耕地面积减少，人口增加，迫切期望小麦年产量快速增加。构成小麦产量的三因素有穗粒数，亩穗数和粒重。穗部性状决定了小穗粒数，在一定程度上与产量有关。另一方面，穗部形态对于小麦物种鉴定也有意义。影响小麦穗粒数的因素有穗长、每穗小穗数以及穗密度，且都属于数量性状。穗密度不仅与小麦的小穗数有关，还与穗长有关，属于数量性状，与穗长、总小穗数、可育小穗数以及不可育小穗数皆属于小麦穗部性状。在一定范围下，增加穗密度值，可以有效的提高小麦的产量。西藏半野生小麦是中国西藏特有的一种小麦资源。它与中国的一般普通小麦具有相同的aabbdd染色体构型，主要分布在雅鲁藏布江隆子河流域、澜沧江流域和察隅河流域耕作粗放的农田里，与冬小麦混生，而没有野生群落。特殊的生长环境赋予了西藏半野生小麦特殊的性状，如包壳、脆碎和休眠等特性。西藏半野生小麦种蕴藏着待鉴定和发掘的宝贵基因资源，对其优良基因资源的利用较普通小麦以外的其他资源更加容易和快捷。分子标记，是在dna水平上直接反应遗传的多态性。分子标记，不受季节环境限制，表达稳定，遍及整个基因组，数量多，高通量，多态性高，检测手段简单、快速，成本低，并且多数标记表现为共显性，可以区分纯合子与杂合子，由于这些特性，分子标记在遗传育种中被广泛地应用。高分辨熔解曲线(hrm)标记是2003年由美国utah大学和idahotechnology公司联合开发的一项新技术，其原理是，双链核苷酸(dsdna)的热稳定受其长度和碱基组成的影响，序列变化导致升温过程中dsdna解链行为的改变，而荧光染料只能嵌入并结合到dsdna上，利用实时pcr技术，通过实时检测dsdna熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将pcr产物中存在的差异直观的展现出来。hrm的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度高和特异性高，pcr产物无需后处理，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险。前人在小麦的1a、1b、2a、2d、3d、4a、4d、5a、5b、5d、6a、7a、7b和7d上检测出控制穗密度的qtl位点，但是相较于穗长、穗粒数和总小穗数，对于穗密度的研究仍然较少。技术实现要素：本发明的目的是提供小麦穗密度qtlqsd.sau-7a连锁的hrm分子标记及其应用。为了实现本发明目的，本发明以西藏半野生小麦(q1028)为母本，以普通小麦品种郑麦9023(zm9023)为父本，杂交得到f1，f1代单株自交获得f2，在f2随机选取186个单株，进行自交，分别收获单株，下一年继续自交，如此重复直到f8代，获得含有186个系的重组自交系，构建该群体的全基因组遗传连锁图谱。根据ssr标记和dart标记，利用joinmap4.0构建遗传图谱。对重组自交系群体的穗长以及小穗数进行考察，继而得到穗密度值。结合表型数据以及分子数据，用qtlicimapping3.2中的完备区间作图法(inclusivecompositeintervalmapping-add，icim-add)，设置阀值lod≥2.5的条件下，检测qtl。在小麦7a染色体上检测到穗密度qtl，即qsd.sau-7a。之后，进一步对该qtl进行了加密，通过比较基因组学方法，与中国春、乌拉尔图、短柄草、大麦以及水稻进行比较获得可能存在于qtl附近的基因，进行同源克隆，寻找多态性位点，根据多态性位点，利用beacondesigner7开发hrm标记。本发明提供的小麦穗密度qtl连锁的hrm标记，所述标记为0c32-715，该标记分别能扩增出101bp的dna片段。本发明还提供上述的分子标记0c32-715在鉴定小麦穗密度qtlqsd.sau-7a中的应用。本发明的穗密度qtlqsd.sau-7a来自西藏半野生小麦q1028，该qtl位于小麦7a染色体(图1)，表现为穗密度值高，即小穗着生更为密集。前述的应用，包括如下步骤：1)提取待测植株的基因组dna；2)以待测植株的基因组dna为模板，利用扩增分子标记0c32-715的引物，进行荧光定量pcr扩增反应；pcr扩增体系：ssofastevagreen超混合液5μl、上游引物和下游引物各300ng、模板dna100ng、dnaes/rnase-free去离子水加至总量为10μl。荧光定量pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、59.1℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。3)根据分析荧光定量pcr后反映的高分辨熔解曲线图，对植株基因型进行分析。如果分析结果与q1028相同，则植株携带有qsd.sau-7a，若与郑麦9023的结果一致，则不携带qsd.sau-7a。本发明还提供所述的分子标记0c32-715在筛选或鉴定穗密度性状的小麦种质资源(例如q1028及其杂交后代)中的应用。前述的应用，包括如下步骤：1)提取待测植株的基因组dna；2)以待测植株的基因组dna为模板，利用扩增分子标记0c32-715的引物，进行荧光定量pcr扩增反应；3)根据分析荧光定量pcr后反映的高分辨熔解曲线图，对植株基因型进行分析。如果分析结果与q1028相同，则植株的穗密度值高，若与郑麦9023一致，则穗密度值第。pcr扩增体系：ssofastevagreen超混合液5μl、上游引物和下游引物各300ng、模板dna100ng、dnaes/rnase-free去离子水加至总量为10μl。荧光定量pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、59.1℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。本发明还提供用于鉴定穗密度性状的小麦种质资源的pcr检测试剂盒，所述检测试剂盒包含扩增所述分子标记0c32-715的引物。本发明进一步提供所述分子标记0c32-715在小麦分子标记辅助育种中的应用。附图说明图1为本发明小麦q1028穗密度qtlqsd.sau-7a在7a染色体上的位置及与分子标记hrm之间的连锁遗传图谱。图2为本发明利用荧光定量pcr引物进行基因型分型的结果图。图3为本发明实施例2中对q1028×郑麦9023的群体后代利用荧光定量pcr引物进行基因型分型的结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1小麦小穗数qsd.sau-7a及其分子标记0c32-715的获得1、以西藏半野生小麦q1028为母本，以小麦品种郑麦9023为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，在f2随机选取186个单株，进行自交，分别收获单株，下一年继续自交，如此重复直到f8代，获得含有186个系的重组自交系，构成遗传作图群体。2、重组自交系群体穗密度特性表型鉴定小麦成熟期对重组自交系的穗长以及小穗数进行表型鉴定。3、dna提取：用ctab法提取亲本q1028、郑麦9023和重组自交系群体植株dna。4、利用比较基因组学方法，与中国春、乌拉尔图、短柄草、大麦以及水稻进行比较，获得可能存在于qtl附近的基因，进行同源克隆，寻找多态性位点，根据多态性位点，利用软件beacondesigner7开发hrm标记。表1标记0c32-715序列信息荧光定量pcr结果(表2，图2)，对比穗密度性状数据发现，株系的基因型数据与株系的性状比较一致。表2q1028×郑麦9023重组自交系0c32-715标记高分辨熔解曲线结果统计株系编号分子标记等位点来源(a:q1028；b:郑麦9023)平均穗密度值36a2.5155a3.03148a3.18277a2.91141b1.58156b1.68174b1.68272b1.65目标qtl(qsd.sau-7a)在上述(q1028×郑麦9023)的ril群体中可解释5.60～7.08％的表型变异。实施例2分子标记0c32-715在鉴定穗密度qtlqsd.sau-7a小麦植株中的应用1、利用(q1028×郑麦9023)的ril群体中的子代qz2为母本，普通小麦品系郑麦9023为父本构建重组自交系，在后代株系中随机选择8个株系。2、对所获得的8个株系进行0c32-715标记检测，具体方法为：在苗期提取8个株系的dna；以其为模板，对分子标记0c32-715进行荧光定量pcr。pcr扩增体系：ssofastevagreen超混合液5μl、上游引物和下游引物各300ng、模板dna100ng、dnaes/rnase-free去离子水加至总量为10μl。荧光定量pcr扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性15s、59.1℃退火30s，共50个循环；熔解曲线范围为65～95℃，每0.2℃读一次数，时间为10s。3、根据分析荧光定量pcr后反映的高分辨熔解曲线图，对植株基因型进行分析(表3，图3)。如果分析结果与qz2相同，则植株的穗密度值高，若与郑麦9023的结果一致，则穗密度值低。表3qz2×zm9023f2代0c32-715高分辨溶解曲线结果统计株系编号分子标记等位点来源(a:qz2；b:zm9023)平均小穗数62a3.45115a4.00171a4.00196a3.50107b1.86360b1.98168b1.91446b2.17虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>四川农业大学<120>小麦穗密度qtl连锁的hrm分子标记及其应用<130>khp171112841.6<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>103<212>dna<213>0c32-715<400>1gtttgttccctccacctaagacttgatgagttctgatagaagatccaacttgctgttctt60ccttaaactttgactcggaacatgtcactttgatagttcaagc103<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2gtttgttccctccacctaa19<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<400>3gcttgaactatcaaagtgacat22当前第1页12