薯蓣皂素的发酵制备方法与流程

本发明属于微生物次生代谢产物技术领域，涉及原料药品皂素的制备工艺优化，具体涉及利用盾叶薯蓣内生菌发酵制备薯蓣皂素的方法。

背景技术：

盾叶薯蓣(dioscoreazingiberensisc.h.wright)为我国特有的薯蓣品种，又称为黄姜，是生产皂素的主要植物原料。薯蓣皂素被医药界称为“药用黄金”，其可以合成皮质激素、蛋白同化激素、性激素等数千种甾体激素类药物。盾叶薯蓣为获取薯蓣皂素的重要原料之一。目前，全世界已发现138种含薯蓣皂素的薯蓣属植物，但是只有10％左右的薯蓣属植物具有工业利用价值。随着薯蓣皂素市场需求缺口的不断增大，盾叶薯蓣已遭受掠夺式的采挖，使得这种珍贵的野生资源逐渐枯竭。长期人工种植盾叶薯蓣已造成薯蓣种质资源退化，使其皂素产量不断降低，且对山区脆弱的生态环境造成了严重的破坏。

在传统的皂素生产过程中，会产生大量废水。这些废水中有机污染物浓度高、色度高、酸度高，因此处理难度极大。盾叶薯蓣的主产区包括湖北、陕西、河南等省。陕西省常年大面积种植盾叶薯蓣，有80余家皂素生产企业，加工量约占全国的50％，其中，汉江流域的上游城市汉中市就有38家皂素生产企业，每年排放污水大约100多万吨。由于许多企业的皂素生产废水直接排入汉江，对南水北调中线水源区水质污染十分严重。根据《南水北调工程总体规划》和当前黄淮海地区水资源短缺的严峻形势，陕西省部分皂素厂家相继停产。为了保护环境，全国一半以上的皂素提取企业停产。这也是导致皂素价格不断上涨的原因之一。

产需缺口大、野生盾叶薯蓣资源日益减少、人工种植质量下降以及环境受到破坏等，已成为薯蓣皂素生产过程中的众多难题，严重影响了我国医药工业对甾体激素类药物的研发与应用。为了寻求上述问题的解决方案，需要改变薯蓣皂素的现有生产模式，这方面的改变主要体现为：一方面选育高产、稳产的薯蓣新品种，采用科学的、规模化的种植方法；另一方面探索环保、高效的薯蓣皂素制备途径。

针对困扰皂素生产企业的污染和原料匮乏等问题，研究者开展了大量的研究并应用于实践。当前的研究和应用方向主要是利用分离菌株发酵或自然发酵盾叶薯蓣地下茎，再分离薯蓣皂素，与常规酸水解法相比，尽管能够充分利用盾叶薯蓣的有效成分，明显提高皂素的提取率，但生产过程中产生大量酸性废水的问题没有得到根本解决。

技术实现要素：

本发明的目的是探索环保、高效的薯蓣皂素制备新工艺，克服采用现有技术制备薯蓣皂素的诸多技术问题。植物内生菌可以产生与其宿主相同或相似的生理活性物质。基于此，本专利的发明人将盾叶薯蓣内生菌作为研发方向，探寻从盾叶薯蓣内生菌的次级代谢产物中提取薯蓣皂素的可能性。这将是解决工业污染和寻找新资源的可行途径之一。

具体而言，本发明给出一种薯蓣皂素的发酵制备方法，采用薯蓣内生菌进行发酵，所述发酵制备方法包括下述步骤：

1)将所述薯蓣内生菌接入种子培养基中进行种子培养，得到发酵菌种。

2)向发酵培养基中加入消泡剂，将步骤1)所述发酵菌种接入盛装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，开启搅拌，设定发酵条件为发酵温度28℃、通气量1.0-5.5l/min。

3)从发酵产物中分离得到所述薯蓣皂素。

进一步地，本发明采用的薯蓣内生菌为地衣芽孢杆菌syb06.11.1，该菌株从盾叶薯蓣中分离得到，保存于cgmcc，保藏时间为2008年1月10日，保藏编号2334。

本专利的发明人于2006年从盾叶薯蓣的根状茎中筛选出一株盾叶薯蓣内生细菌。通过菌落特征、细胞形态、生理生化特性鉴定该菌株属于芽孢杆菌属。随后用分子生物学的方法，对该菌株的its序列、16srdna序列进行测定，并用blast进行比对，发现其与bacilluslicheniformisasc585的16srdna同源性为99％，从而确定其属于地衣芽孢杆菌，并命名为endophyticbacilluslicheniformissyb06.11.1。有关该菌株的筛选方法以及菌株的鉴定和保藏信息，在专利zl200810150274.3中已有明确记载，在此不作赘述。在本专利中，上述地衣芽孢杆菌endophyticbacilluslicheniformissyb06.11.1简记为syt1，本专利中的syt1与专利zl200810150274.3中明确记载的菌株相同。通过对syt1的发酵产物进行柱层析和结晶，得到结晶体，后经nmr确定其结构为甾体皂甙元，并对该皂甙元的熔点和旋光度进行了测定，确定syt1菌株可以发酵生产薯蓣皂素。

基于上述研究，本发明的实施例通过对syt1的种子培养基、发酵培养基、发酵温度、摇床转速等因素进行优化，并利用正交试验设计和响应面分析法优化了薯蓣皂素的分离工艺。

本发明的实施例建立了小罐发酵生产皂素的基本工艺，优选地，这种发酵罐的容积为5l或3l。为了消除发酵过程中因搅拌、通气等因素引起的气泡，在发酵培养基中加入一定量的消泡剂。作为一优化的发酵方法，所述消泡剂的计入量为发酵罐中发酵培养基体积的千分之一。在另外的实施例中，本领域的技术人员，在本发明的技术启示下还可以对消泡剂的计入量进行优化选择。

作为一优化的发酵方法，所述薯蓣皂素的发酵制备方法的发酵时间为100-180h。进一步优选地，发酵时间设定为168h。

向发酵罐中的通气量对所述薯蓣皂素的产量具有直接的影响。作为一优化的发酵方法，所述薯蓣皂素的发酵通气量设定为5.5l/min。

本发明还给出了发酵产物的处理方法，具体为，向发酵液中加入浓盐酸，在沸水浴条件下酸水解发酵液，待水解液冷却至室温后，向水解液中加入碱溶液调节水解液ph至中性，过滤，得到滤液和滤渣，所述薯蓣皂素从滤液和/或滤渣中分离得到。

作为一优化的所述薯蓣皂素的分离，从滤液中分离所述薯蓣皂素用二氯甲烷对滤液进行萃取；从滤渣中分离所述薯蓣皂素用石油醚对滤渣进行提取。进一步优选地，所述萃取滤液的二氯甲烷用量与滤液等体积；所述提取滤渣的石油醚沸程为60-90℃。

适用于本发明的发酵方法的所述种子培养基的组成为牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000ml，种子培养基的ph7.0-7.2。

适用于本发明的发酵方法的所述发酵培养基的组成为蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化钠7g、磷酸氢二钾1g、玉米浆6g、糊精14g、碳酸钙10g、水1000ml。

本发明所述薯蓣皂素的发酵制备方法，至少具有下述的有益效果或优点。

本发明以盾叶薯蓣内生菌syt1作为薯蓣皂素扩大化制备的菌株，建立了小罐发酵生产薯蓣皂素的基本工艺。通过对syt1的种子培养基、发酵培养基、发酵温度、摇床转速等单因素进行优化，使得薯蓣皂素产量得以显著提高，大幅缩短了发酵周期。本发明所述薯蓣皂素生产工艺，大大提高了薯蓣皂素的产量，克服现有薯蓣皂素生产方法的产量小、耗能高的技术缺陷。本发明为syt1菌株开发的前期应用研究奠定了基础。

附图说明

图1是不同通气量对薯蓣皂素产量的影响。

图2是滤饼渣及滤液中薯蓣皂素的产量对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明的目的、技术方案及其效果，现将结合实施例对本发明做进一步详细阐述。

实施例1

本实施例提供一种薯蓣皂素的发酵制备方法。这种制备薯蓣皂素的方法不同于现有从薯蓣中分离纯化获得薯蓣皂素的制备方法，其以盾叶薯蓣内生菌syt1为出发菌株，通过特定的发酵工艺从其发酵液中分离获得。本实施例采用的盾叶薯蓣内生菌syt1为地衣芽胞杆菌syb06.11.1，菌株保存于cgmcc，保藏时间为2008年1月10日，保藏编号2334。有关该菌株的分离鉴定，以及其代谢产物盾叶薯蓣皂苷元的分离参见专利zl200810150274.3。

本实施例所述发酵制备薯蓣皂素的方法，包括下述步骤。

第一步，盾叶薯蓣内生菌syt1的扩大培养。

具体操作描述为：将纯化的盾叶薯蓣内生菌syt1接入种子培养基中进行种子培养，待其种群群落扩展到一定数量后，即可作为下一步的发酵菌种。

涉及的种子培养基，其组成为牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、水1000ml，种子培养基的ph7.0-7.2。

第二步，接种发酵。

向发酵培养基中加入消泡剂，作为实施例的优选，所述消泡剂的计入量为发酵罐中发酵培养基体积的千分之一。将第一步获得的发酵菌种接入盛装有发酵培养基的发酵罐中，开启搅拌，设定发酵条件进行发酵生产。

关于搅拌及其搅拌速度，本领域技术人员可以采用人工搅拌或是电机驱动的方式，以电机驱动搅拌为优选，搅拌速度设定为100-500rpm，进一步优选地，经多次的实践尝试，以400rpm的搅拌速度，可以获得较为理想的发酵效果。其他的发酵条件还包括发酵温度28℃、通气量1.0-5.5l/min。对于发酵时间，其应具有一个合理的时间段，但生产实际中，向发酵罐中接入发酵菌种即说明发酵的开始，也就有目标次生代谢产物的生成，只不过在发酵初期，目标次生代谢产物的量较少，当发酵进行到一定程度后，发酵液中的目标次生代谢产物的量区域平稳。在本实施例中，理论上而言，发酵时间可以设定为0-180h，或者可以将发酵时间进一步延长至210h，这也是本领域技术人员通过本实施例可以直接获知的。进一步优选地，发酵时间可以初步设定为100-180h。

涉及的发酵培养基，其组成为蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化钠7g、磷酸氢二钾1g、玉米浆6g、糊精14g、碳酸钙10g、水1000ml。

第三步，酸解发酵液。

从盾叶薯蓣内生菌的发酵液中分离获得薯蓣皂素，还需要对发酵液进行酸解，再对酸解后的发酵液进行中和。酸解发酵液的具体操作为，向发酵液中加入浓盐酸，在沸水浴条件下酸水解发酵液，待水解液冷却至室温后，向水解液中加入碱溶液调节水解液ph至中性，过滤，得到滤液和滤渣，所述薯蓣皂素从滤液和/或滤渣中分离得到。

为了进一步验证盾叶薯蓣内生菌发酵制备薯蓣皂素，本实施例还进一步给出薯蓣皂素的检测方法及定量方法。

向样品发酵液中加入浓盐酸，使发酵液中盐酸浓度达到2mol/l。在沸水浴条件下酸水解4h，冷却至室温，向水解液中加入naoh溶液调节ph至中性，过滤后留滤渣。在90℃水浴条件下，使用250ml沸程为60-90℃的石油醚对滤渣进行索氏提取4h，提取得到的皂素粗品用于发酵液中皂素浓度测定。

用氯仿将培养皿内挥发至干的薯蓣皂素粗提物溶解，将溶解液转入10ml磨口具塞试管中，再用少量氯仿将培养皿冲洗两次，以保证粗提物中的薯蓣皂素完全被洗下，冲洗液同样转入磨口具塞试管中，用氯仿定容至10ml，取4ml已定容的皂素粗品溶液，然后加入4mlliebermann-barcharad试剂，用氯仿滴加至刻度，塞上磨口塞，摇匀，于50℃中恒温水浴60min，取出冷却至室温，用分光光度计在波长为460nm处测定其吸光值。

实施例2

本实施例建立了小罐发酵生产皂素的基本工艺，即用容积为5l或3l的发酵罐进行盾叶薯蓣内生菌发酵。本实施例对上述的发酵条件进行了优化，寻求发酵法生产薯蓣皂素的工艺条件。

(1)通气量优化

以发酵培养基为基础进行通气量的优化，涉及的发酵培养基组成为蔗糖100g、蛋白胨50g、酵母粉15g、氯化钠7g、磷酸氢二钾1g、玉米浆6g、糊精14g、碳酸钙10g、水1000ml。图1显示了不同通气量对薯蓣皂素产量的影响。由图1可知，分别设置通气量为1l/min、3l/min、4.5l/min、5.5l/min，进行5l小罐发酵实验，发酵结束后，测定薯蓣皂素的产量。通气量优化实验的发酵条件设定为发酵温度28℃，搅拌速度400rpm，发酵时间168h。不同通气量所对应的薯蓣皂素产量见图1，从图1中可以看出，通气量的增加能显著提高薯蓣皂素的产量，最佳通气量为5.5l/min，相应的薯蓣皂素产量为437.36mg/l，是对照组(1l/min)产量69.59mg/l的6.28倍。

(2)滤饼渣及滤液中薯蓣皂素的产量

将盾叶薯蓣内生菌syt1接入基础培养基中进行小罐发酵，培养条件设定为通气量5.5l/min、发酵温度28℃、搅拌速度400rpm、发酵时间168h。发酵结束后，向50ml样品发酵液中加入浓盐酸，使发酵液中盐酸浓度达到2mol/l。在沸水浴条件下酸水解4h，冷却至室温，向水解液中加入naoh溶液调节ph至中性，过滤后得到滤渣和滤液。采用不同的薯蓣皂素提取工艺，分别从滤渣和滤液分离薯蓣皂素。在90℃水浴条件下，使用250ml沸程为60℃-90℃的石油醚对滤渣进行索氏提取4h，提取得到的皂素粗品用于发酵液中皂素浓度测定。用等体积的二氯甲烷对滤液萃取两次，萃取条件为：等体积，6小时，200rmp，浓缩后测量皂素产量。

图2给出了滤饼渣及滤液中薯蓣皂素的产量对比。从图2中可以看出，薯蓣皂素主要存在于滤液中，经168h时发酵，薯蓣皂素的产量达到最高为716.31mg/l，为滤渣中薯蓣皂素含量的1.64倍。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。