一种分步发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽液的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分步发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽液的方法。

背景技术：

甲鱼的养殖在中国市场具有较高的经济价值，甲鱼蛋作为甲鱼养殖的副产物，除了少部分孵化场会将受精蛋孵化成甲鱼苗出售，大部分的甲鱼蛋都只是被用作普通食品原料加工甚至被丢弃，造成了一定的资源浪费。

人体的正常生理代谢会产生一些活性氧自由基，这些自由基能够破坏蛋白质、脂肪、核酸等，导致细胞损坏甚至凋亡，对人体造成损害。而抗氧化性活性肽可以通过向自由基提供质子或电子来抑制自由基链式反应进行、清除自由基、抑制脂质过氧化，或鳌合金属离子等不同途径来发挥抗氧化作用。

目前，抗氧化肽的获取方式主要有化学合成、蛋白酶酶解、发酵等方式。徐怀德等人对甲鱼蛋白进行酶水解得到了抗氧化活性肽；杨明毅等人申请了“一种将甲鱼蛋进行酶解法水解制备抗氧化活性液的方法”cn201510150779.x的专利，在此领域具有一定的突破性。但是此方法存在成本高、水解条件要求严格、产生的酶解产物具有令人不悦的苦味等缺陷，限制了抗氧化肽的应用。

发酵法是以甲鱼蛋液为发酵液，接入产蛋白酶的微生物，利用微生物发酵过程中产生的蛋白酶将蛋白酶解成抗氧化肽。发酵方法与酶解法相比，能将微生物产酶和酶水解两步合一，省去了酶的分离和提纯步骤，减少了生产工序，降低了成本；此外，微生物除了产生蛋白酶外，还能产生纤维素酶、植酸酶等，可以分解细胞壁，有利于蛋白与蛋白酶的活性位点结合，提高水解效率，增加酶解产物的抗氧化活性且微生物产生的端肽酶对小肽末端的修饰作用，使制得的肽具有发酵的天然芳香味，适口性更好。

现有报道的发酵法制备抗氧化肽，主要集中在花生、菜籽粕、豆粕、鱼蛋白、乳清蛋白等原料，其效果并不理想，且未见利用微生物发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽的相关报道。

技术实现要素：

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种一种分步发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽液的方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述分步发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽液的方法包括如下步骤：

（1）对甲鱼蛋进行清洗和干燥，并用验光机对清洗和干燥后的甲鱼蛋进行光照挑选，除去变质的甲鱼蛋，得到健康的甲鱼蛋；

（2）将选好的甲鱼蛋放入搅拌机，注入2～5倍甲鱼蛋体积的无菌去离子水，搅拌时间为5～25min，搅拌速度200～800r/min；

（3）碟片式离心机离心，转速3000～6000rpm，时间10～20min，去除上层的的少量油脂和底层的甲鱼蛋壳，得到中层的甲鱼蛋膜、蛋清、蛋黄混合液（即甲鱼蛋混合液）；

（4）将甲鱼蛋混合液加入葡萄糖10~20g/l，于100～120℃，压力0.08～0.1mpa条件下灭菌15～30min；

（5）将灭菌后的甲鱼蛋混合液冷却至室温后，加入枯草芽孢杆菌菌种种子培养液，进行液体发酵，发酵温度为32～38℃，发酵初始ph值味7.0～7.5，发酵时间为12～36h，所述枯草芽孢杆菌菌种种子培养液种量占甲鱼蛋混合液体积的3～8％；

（6）向经步骤（5）液体发酵处理后的甲鱼蛋混合液中加入乳酸菌菌种种子培养液，进行液体静止发酵，发酵温度为37～47℃，发酵初始ph值味6.0～6.5，发酵时间为12～24h，所述乳酸菌菌种种子培养液种量占甲鱼蛋混合液体积的3～8％；

（7）将经步骤（6）液体静止发酵处理后的甲鱼蛋混合液升温至70～98℃，维持10～20min，使菌种失活；冷却至室温，即得抗氧化肽液，灌装保存。

优选地，在步骤（5）液体发酵期间不断搅拌、供氧。

优选地，步骤（5）所述枯草芽孢杆菌菌种种子培养液的制备方法如下：将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180～200r/min、32～38℃恒温振荡培养20～24h；所述种子培养基组分为：蛋白胨30g/l、nacl5g/l、牛肉膏5g/l及葡萄糖1g/l、ph7.2，若种子培养基为固体培养基则还添加琼脂2.5g/l。种子培养基于121℃下灭菌20min，冷却即可。

优选地，步骤（6）所述乳酸菌菌种种子培养液的制备方法如下：将乳酸菌斜面菌种活化，连续传代5次后接入mrs液体培养基，37℃静止培养36h；所述种子培养基组分为：牛肉膏10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、葡萄糖20g/l、醋酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、吐温800.1g/l、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.28g/l、ph6.2～6.4。121℃灭菌15min，冷却即可。

本发明将甲鱼蛋进行液体搅拌破碎的同时，保留了普通碎蛋方式丢弃的蛋壳膜这一良好的抗氧化肽原料，得到的甲鱼蛋混合液，分步以枯草芽孢杆菌和乳酸菌进行发酵，更好地发挥了各发酵菌的优势，制备的抗氧化肽制具有更好的抗氧化性。

与杨明毅等人申请的“一种将甲鱼蛋进行酶解法水解制备抗氧化活性液的方法”相比，本发明更适合工业化生产，且水解度更高（高6.68%）、得到的酶解液的抗氧化能力更强（总抗氧化能力是原方案的3.46倍，羟自由基清除率和超氧阴离子清除率分别比原方案高16.27%和8.98%），可应用于化妆品、保健品、食品加工等领域。

附图说明

图1为改进前后方案水解度对比；其中：样品1为改进前方案所得酶解液（未经分子膜过滤），样品2为本发明所得抗氧化肽液；

图2为改进前后方案总抗氧化能力对比；其中：样品1为改进前方案所得酶解液（未经分子膜过滤），样品2为本发明所得抗氧化肽液；

图3为改进前后方案羟自由基清除能力对比；其中：样品1为改进前方案所得酶解液（未经分子膜过滤），样品2为本发明所得抗氧化肽液；

图4为改进前后方案超氧阴离子清除能力对比；其中：样品1为改进前方案所得酶解液（未经分子膜过滤），样品2为本发明所得抗氧化肽液。

具体实施方式

所述分步发酵甲鱼蛋制备抗氧化肽液的方法包括如下步骤：

（1）对甲鱼蛋进行清洗和干燥，并用验光机对清洗和干燥后的甲鱼蛋进行光照挑选，除去变质的甲鱼蛋，得到健康的甲鱼蛋；

（2）将选好的甲鱼蛋放入搅拌机，注入2～5倍甲鱼蛋体积的无菌去离子水，搅拌时间为5～25min，搅拌速度200～800r/min；

（3）碟片式离心机离心，转速3000～6000rpm，时间10～20min，去除上层的的少量油脂和底层的甲鱼蛋壳，得到中层的甲鱼蛋膜、蛋清、蛋黄混合液（即甲鱼蛋混合液）；

（4）将甲鱼蛋混合液加入葡萄糖10~20g/l，于100～120℃，压力0.08～0.1mpa条件下灭菌15～30min；

（5）将灭菌后的甲鱼蛋混合液冷却至室温后，加入枯草芽孢杆菌菌种种子培养液，进行液体发酵，发酵温度为32～38℃，发酵初始ph值味7.0～7.5，发酵时间为12～36h，所述枯草芽孢杆菌菌种种子培养液种量占甲鱼蛋混合液体积的3～8％；液体发酵期间不断搅拌、供氧；

（6）向经步骤（5）液体发酵处理后的甲鱼蛋混合液中加入乳酸菌菌种种子培养液，进行液体静止发酵，发酵温度为37～47℃，发酵初始ph值味6.0～6.5，发酵时间为12～24h，所述乳酸菌菌种种子培养液种量占甲鱼蛋混合液体积的3～8％；

（7）将经步骤（6）液体静止发酵处理后的甲鱼蛋混合液升温至70～98℃，维持10～20min，使菌种失活；冷却至室温，即得抗氧化肽液，灌装保存。

其中，步骤（5）所述枯草芽孢杆菌菌种种子培养液的制备方法如下：将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种单菌落接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180～200r/min、32～38℃恒温振荡培养20～24h；所述种子培养基组分为：蛋白胨30g/l、nacl5g/l、牛肉膏5g/l及葡萄糖1g/l、ph7.2，若种子培养基为固体培养基则还添加琼脂2.5g/l。种子培养基于121℃下灭菌20min，冷却即可。步骤（6）所述乳酸菌菌种种子培养液的制备方法如下：将乳酸菌斜面菌种活化，连续传代5次后接入mrs液体培养基，37℃静止培养36h；所述种子培养基组分为：牛肉膏10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、葡萄糖20g/l、醋酸钠5g/l、柠檬酸二铵2g/l、吐温800.1g/l、硫酸镁0.58g/l、硫酸锰0.28g/l、ph6.2～6.4。121℃灭菌15min，冷却即可。

结果测定：

1、相对水解度（dh）测定：三氯乙酸法

三氯乙酸（tca）为强酸，具有良好的蛋白沉淀作用，从而去除大分子的蛋白质。取酶解液10ml，加入10%tca溶液，摇匀并静置30min，10000g，离心15min，使未水解的大分子蛋白质沉淀，与小分子可溶性蛋白分开，测定可溶性蛋白占总蛋白的含量，求得水解度，即可溶性蛋白占总蛋白的百分比。

水解度计算公式：

dh（%）＝（n1-n0）/n*100%

式中：n0---蛋白水解前可溶蛋白含量(mg)；

n1---蛋白水解后可溶蛋白含量(mg)；

n---总蛋白含量(mg，考马斯亮蓝g-250染料法)。

各样品重复3组，取平均值为最终水解度，发酵法得到的抗氧化肽液（样品2）的水解度为20.46%，比蛋白酶水解（即，杨明毅等人申请的“一种将甲鱼蛋进行酶解法水解制备抗氧化活性液的方法”cn201510150779.x）得到的酶解液（未经分子膜过滤）（样品1，水解度为13.78%）高出6.68%，详见图1。

2、抗氧化性能力测定（使用北京索莱宝科技有限公司总抗氧化能力（t-aoc）检测试剂盒（frap法）分光光度法bc1310）

测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。

原理：在酸性环境下，还原fe³⁺-三吡啶三吖嗪(fe³⁺-tptz)产生蓝色的fe²⁺-tptz的能力反映了总抗氧化能力。

总抗氧化能力计算：

总抗氧化能力（单位/毫克）=(1÷0.6308)×（a△-0.1291）÷样品质量×样本测定前稀释倍数。

各管净吸光度变化值a△=od△测定管-od对照管，即a△对应为标准曲线的od593。

各样品重复3组，取平均值为最终总抗氧化能力，发酵法得到的抗氧化肽液（样品2）的总氧化能力为190.53单位/克，蛋白酶水解得到的酶解液（未经分子膜过滤）（样品1，总氧化能力为55.10单位/克）的3.46倍，详见图2。

3、羟自由基清除能力测定（使用北京索莱宝科技有限公司羟自由基清除能力测定试剂盒分光光度法bc1320）

羟自由基作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病。羟自由基清除能力是样品抗氧化能力的重要指标之一。

原理：h2o2/fe²⁺通过fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-fe²⁺水溶液中fe²⁺氧化为fe³⁺，导致536nm吸光度下降，样品对536nm吸光度下降速率的抑制程度，反映了样品清除羟自由基的能力。

计算公式：

羟自由基清除率d%=（a测-a对）÷（a空-a对）×100%

a空、a对、a测：空白管、对照管和测定管的吸光值。

各样品重复3组，取平均值为最终羟自由基清除能力，发酵法得到的抗氧化肽液（样品2）的羟自由基清除率，比蛋白酶水解得到的酶解液（未经分子膜过滤）（样品1，羟自由基清除率为30.46%）高16.27%，详见图3。

4、超氧阴离子清除能力测定（使用北京索莱宝科技有限公司超氧阴离子清除能力试剂盒分光光度法bc1410）

超氧阴离子自由基作为生物体代谢过程中产生的一种自由基，可攻击生物大分子，如脂质、蛋白质、核酸和聚不饱和脂肪酸等，使其交链或者断裂，引起细胞结构和功能的破坏，与机体衰老和病变有很密切的关系，清除超氧阴离子自由基的研究已经得到了广泛的关注。

测定原理

ap-temed系统产生超氧阴离子，与盐酸羟胺反应生成no2^－，no2^－与对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，样品对超氧阴离子的清除能力与530nm的吸光值呈负相关。

计算公式：

超氧阴离子清除率i%=（a对照管-a测定管）/a对照管*100%

各样品重复3组，取平均值为最终超氧阴离子清除能力，发酵法得到的抗氧化肽液（样品2）的超氧阴离子清除率为35.18%，比蛋白酶水解得到的酶解液（未经分子膜过滤）（样品1，超氧阴离子清除率为26.20%）高8.98%，详见图4。