本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺。
背景技术：
：心力衰竭是一个重大的公共卫生难题，研究显示：中国35岁以上人群中患病率高达2％，患者约1000万人，并且每年新增患者50万例，严重威胁我国人民的生命健康安全，随着人口老龄化，我国的心力衰竭患者数量还将进一步上升。重组人脑利钠肽(rhbnp，商品名：新活素)，能够有效治疗心力衰竭等病症，快速缓解患者呼吸困难、利尿排钠、拮抗神经内分泌、抗心脏重塑，对心脏起到全面保护作用，已被《中国心力衰竭诊断和治疗指南(2014年版)》载入并推荐使用。现阶段，重组人脑利钠肽主要是通过基因重组技术制备得到，它利用rhbnp基因工程菌发酵培养，然后，分离纯化，制剂，最终得到重组人脑利钠肽产品；其中，发酵工艺是决定重组人脑利钠肽产量的关键步骤之一，它直接影响到融合蛋白表达量的高低，如果蛋白表达量过低，将会导致单位产品的生产成本大幅度增加，从而被认为不具有商业开发价值，进而也就无法实现产业化生产。因此，为了能够实现重组人脑利钠肽的产业化生产，降低单位产品的生产成本，首要任务就是开发一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺。本发明提供的一种提高重组人脑利钠肽融合蛋白表达量的发酵工艺，它包括以下步骤：在发酵罐中，加入bhd培养基18l～20l和甘油65ml～80ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽基因工程菌300ml～500ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量为30％～50％，调节ph值为6.8～7.2，培养温度为37℃；当od600为10～15时，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5mmol/l～1.0mmol/l诱导，并向发酵罐内流加150ml/h～300ml/h的补料液a，3h～6h后停止发酵培养，收获细菌，即可；其中，所述bhd培养基的配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氢钾2g～5g、磷酸氢二钾10g～15g、硫酸镁0.4g～1g、氯化钠0.4g～1g、维生素10mg～15mg和微量金属元素20mg～30mg，溶剂为水；所述补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨150g～200g、酵母粉60g～100g和甘油160ml～220ml，溶剂为水。进一步的，加入bhd培养基18.5l和甘油74ml；或者，加入bhd培养基20l和甘油68ml。进一步的，接种重组人脑利钠肽基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量为30％～50％，调节ph值为7.0。进一步的，当od600为12时，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5mmol/l～1.0mmol/l诱导，并向发酵罐内流加200ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养。进一步的，所述bhd培养基的配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨5g、酵母粉10g、磷酸二氢钾2.31g、磷酸氢二钾12.54g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.6g、维生素13.68mg和微量金属元素25.8mg，溶剂为水。进一步的，所述维生素选自泛酸、叶酸、吡哆醇中的一种或两种以上；所述微量金属元素选自六水三氯化铁、四水氯化锌、六水氯化钙、五水硫酸铜中的一种或两种以上。进一步的，所述维生素是由以下重量份数的组分组成：泛酸10份～12份、叶酸0.05份～0.1份、吡哆醇2.5份～3份；优选的，所述维生素是由以下重量份数的组分组成：泛酸10.8份、叶酸0.08份、吡哆醇2.8份。进一步的，所述微量金属元素是由以下重量份数的组分组成：六水三氯化铁12份～15份、四水氯化锌2份～5份、六水氯化钙2份～5份、五水硫酸铜2份～5份；优选的，所述微量金属元素是由以下重量份数的组分组成：六水三氯化铁14份、四水氯化锌4份、六水氯化钙4份、五水硫酸铜3.8份。进一步的，所述补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨172g、酵母粉86g和甘油200ml，溶剂为水。本发明还提供了一种用于重组人脑利钠肽基因工程菌发酵的bhd培养基，其配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨4g～6g、酵母粉8g～12g、磷酸二氢钾2g～5g、磷酸氢二钾10g～15g、硫酸镁0.4g～1g、氯化钠0.4g～1g、维生素10mg～15mg和微量金属元素20mg～30mg，溶剂为水。本发明发酵工艺，采用特定的工艺步骤和工艺条件，以及特定配方的培养基，显著地提高了rhbnp融合蛋白的表达水平，其表达量高达34.5％～38.3％，具有十分良好的商业开发价值；而且，本发明发酵工艺稳定可靠、重复性好，便于操作和控制，单位产品的生产成本低，已成功应用于重组人脑利钠肽的产业化生产，累计实现数百万支注射用重组人脑利钠肽产品的生产和销售，取得了商业上的极大成功。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1为三批重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌发酵培养后全菌蛋白的sds-page电泳图谱，其中：m-marker，0-诱导前，1-第一批，2-第二批，3-第三批。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备等均为已知产品，可以通过购买市售产品等方式获得，例如：重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌：由西藏诺迪康药业股份有限公司或成都诺迪康生物制药有限公司提供，可以通过购买获得；胰蛋白胨(tryptone)、酵母粉(yeastextract)：为oxoid市售产品。实施例1在发酵罐中，加入bhd培养基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为50％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为7.0，培养温度为37℃；当od600(是指在600nm波长处的吸光值)为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.5mmol/l(mmol/l是指毫摩尔/升)诱导，并向发酵罐内流加200ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，bhd培养基的配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氢钾(kh2po4)2.31g、磷酸氢二钾(k2hpo4)12.54g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)0.6g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金属元素(六水三氯化铁14mg、四水氯化锌4mg、六水氯化钙4mg、五水硫酸铜3.8mg)，溶剂为水；补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达情况，结果见图1和表1。表1、发酵培养后rhbnp融合蛋白表达量批次rhbnp融合蛋白表达量第一批38.3％第二批37.5％第三批37.8％实施例2在发酵罐中，加入bhd培养基20l和甘油68ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为30％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为7.0，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为1.0mmol/l诱导，并向发酵罐内流加200ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，bhd培养基的配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氢钾(kh2po4)2.31g、磷酸氢二钾(k2hpo4)12.54g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)0.6g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金属元素(六水三氯化铁14mg、四水氯化锌4mg、六水氯化钙4mg、五水硫酸铜3.8mg)，溶剂为水；补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为34.5％。实施例3在发酵罐中，加入bhd培养基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为50％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为7.0，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.8mmol/l诱导，并向发酵罐内流加200ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，bhd培养基的配方为：每升bhd培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)5g、酵母粉(yeastextract)10g、磷酸二氢钾(kh2po4)2.31g、磷酸氢二钾(k2hpo4)12.54g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)0.6g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金属元素(六水三氯化铁14mg、四水氯化锌4mg、六水氯化钙4mg、五水硫酸铜3.8mg)，溶剂为水；补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为35.8％。对比例1在发酵罐中，加入lb1培养基18.5l和甘油74ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为70％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为6.8，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为1.5mmol/l诱导，并向发酵罐内流加200ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，lb1培养基的配方为：每升lb1培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)10g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金属元素(六水三氯化铁14mg、四水氯化锌4mg、六水氯化钙4mg、五水硫酸铜3.8mg)，溶剂为水；补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为25.6％。对比例2在发酵罐中，加入lb1培养基18.5l和葡萄糖92g，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为25％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为6.9，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为1.2mmol/l诱导，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，lb1培养基的配方为：每升lb1培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)10g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)和微量金属元素(六水三氯化铁14mg、四水氯化锌4mg、六水氯化钙4mg、五水硫酸铜3.8mg)，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为19.2％。对比例3在发酵罐中，加入lb2培养基20l和葡萄糖85g，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为15％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为7.2，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为0.1mmol/l诱导，并向发酵罐内流加100ml/h的补料液b，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，lb2培养基的配方为：每升lb2培养基中，含有胰蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、硫酸镁(mgso4)0.5g、氯化钠(nacl)10g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶剂为水；补料液b的配方为：每升补料液b中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和葡萄糖250g，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为22.5％。对比例4在发酵罐中，加入m9ca培养基18.5l和甘油70ml，以及氨苄青霉素至其终浓度为100mg/l，接种重组人脑利钠肽(rhbnp)基因工程菌400ml，调节通气量使发酵液中的溶氧量(即d.o.值)为10％，加盐酸或氢氧化钠调节ph值为6.9，培养温度为37℃；当od600为12时，加入iptg(异丙基硫代半乳糖苷)至其终浓度为1.5mmol/l诱导，并向发酵罐内流加180ml/h的补料液a，4h后停止发酵培养，收获细菌；其中，m9ca培养基的配方为：每升m9ca培养基中，含有m9盐溶液(5×，ph＝7.4)200ml、酪蛋白氨基酸(casaminoacid)2g、葡萄糖5g、维生素(泛酸10.8mg、叶酸0.08mg、吡哆醇2.8mg)，溶剂为水；补料液a的配方为：每升补料液a中，含有胰蛋白胨(tryptone)172g、酵母粉(yeastextract)86g和甘油200ml，溶剂为水；利用凝胶成像系统，测定重组人脑利钠肽(rhbnp)融合蛋白表达量，结果为14.7％。上述结果表明，本发明发酵工艺，采用特定的工艺步骤和工艺条件，以及特定配方的培养基，显著地提高了rhbnp融合蛋白的表达水平，其表达量高达34.5％～38.3％，具有十分良好的商业开发价值；而且，本发明发酵工艺稳定可靠、重复性好，便于操作和控制，单位产品的生产成本低，已成功应用于重组人脑利钠肽的产业化生产，累计实现数百万支注射用重组人脑利钠肽产品(商品名：新活素)的生产和销售，取得了商业上的极大成功。当前第1页12