一种酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法及其应用与流程

本发明涉及分支环糊精的合成技术领域，尤其是涉及一种通过双酶复合法制备分支环糊精的方法及其应用。

背景技术：

环糊精也称作环麦芽寡糖，是由若干α-d吡喃葡萄糖单元通过α-1,4糖苷键链接而成的一类低聚糖的总称。环糊精因其水溶性较差、具有较高的溶血性和肾毒性导致其应用收到严重的限制，因此对环糊精的改性十分必要。

环糊精的改性方法有化学法或生物酶的方法来修饰环糊精，将某些特定的取代基接枝到环糊精上，这种在保留环糊精空腔结构基本不变的情况下引入取代基团而得到的改性产物，通常称之为修饰环糊精，或改性环糊精，或环糊精衍生物。当取代基为糖基时，通常将其称之为分支环糊精，如葡萄糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、半乳糖基环糊精和甘露糖环糊精等。

相比于环糊精，分支环糊精具有更好的水溶性、更低的肾毒性及溶血性而被广泛应用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法。本发明方法反应条件温和，同时利用cgtase微弱的耦合活力可以水解环状糊精及未反应的底物，从而实现分支环糊精的有效分离；此外，本发明方法可延伸应用至普鲁兰酶制备分支环糊精方法的分离步骤。

本发明的技术方案如下：

一种酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入cgtase酶反应12-24h；

(2)采用物理的方法降低酶活；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入糖化酶反应12-24h，高温灭酶，可制得分支环糊精。

步骤(1)中所述磷酸盐缓冲液的ph在3.5-8.0。

步骤(1)中所述麦芽糊精的质量浓度为1％-5％。

步骤(2)中所述物理方法为70-100℃水浴加热。

一种所述酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法的应用，所述方法可用于制备葡萄糖基-α-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、葡萄糖基-γ-环糊精。

用于制备葡萄糖基-α-环糊精时，具体步骤为：

(1)将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入α-cgtase酶反应12-24h；

(2)采用物理的方法降低酶活；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入糖化酶反应12-24h，高温灭酶，可制得含有葡萄糖基-α-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基-α-环糊精；

所述磷酸盐缓冲液的ph在3.5-8.0；所述麦芽糊精的质量浓度为1％-5％；所述物理方法为70-100℃水浴加热。

用于制备葡萄糖基-β-环糊精时，具体步骤为：

(1)将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入β-cgtase酶反应12-24h；

(2)采用物理的方法降低酶活；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入糖化酶反应12-24h，高温灭酶，可制得含有葡萄糖基-β-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基-β-环糊精；

所述磷酸盐缓冲液的ph在3.5-8.0；所述麦芽糊精的质量浓度为1％-5％；所述物理方法为70-100℃水浴加热。

用于制备葡萄糖基-γ-环糊精时，具体步骤为：

(1)将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入γ-cgtase酶反应12-24h；

(2)采用物理的方法降低酶活；

(3)向步骤(2)的反应体系中加入糖化酶反应12-24h，高温灭酶，可制得含有葡萄糖基-γ-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基-γ-环糊精；

所述磷酸盐缓冲液的ph在3.5-8.0；所述麦芽糊精的质量浓度为1％-5％；所述物理方法为70-100℃水浴加热。

一种所述酶法处理麦芽糊精制备分支环糊精的方法的应用，所述方法可用于鲁兰酶逆向合成法制备单一分支环糊精；具体步骤为：

(1)取通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含分支环糊精的混合物粉末，溶于ph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将步骤(1)所得溶液置于0℃-20℃条件下，结晶12-24h；

(3)将步骤(2)所得溶液离心，取上清液加入ph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应体系中同时加入cgtase和糖化酶，45℃的条件下反应1-10h；

(5)通过膜分离的方法对步骤(4)的反应产物进行分离纯化，即得所述单一分支环糊精；

所述单一分支环糊精为葡萄糖基-α-环糊精、葡萄糖基-β-环糊精、葡萄糖基-γ-环糊精、麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖基-γ-环糊精、半乳糖基-α-环糊精、半乳糖基-β-环糊精、半乳糖基-γ-环糊精中的一种。

本发明有益的技术效果在于：

本发明利用了cgtase的微弱的耦合活力打破副产物环状糊精的环状结构，然后在糖化酶的作用下将已经开环的环状结构进行水解，环状结构在cgtase和糖化酶的共同作用下边开环，边水解，最终将副产物环状的环糊精水解为小分子的葡萄糖，从而实现分支环糊精的有效分离。

本发明主要利用了cgtase的环化活力来制备分支环糊精，然后加入的糖化酶可以促进cgtase酶反应向着耦合活力的方向进行，从而将副产物环状糊精水解为葡萄糖，实现了分支环糊精的有效分离。

本发明方法可以应用于其他方法制备(普鲁兰酶逆向合成分支环糊精)得到分支环糊精的分离过程。

附图说明

图1为本发明实施例2中步骤(1)产物的高效液相色谱图；

图2为本发明实施例2中步骤(3)产物的高效液相色谱图；

图3为本发明实施例5步骤(3)、(4)产物的高效液相色谱图；

图4为本发明实施例8步骤(4)、(5)产物的高效液相色谱图。

具体实施方式

实施例1

一种酶法处理麦芽糊精制备葡萄糖基-α-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取10mg的麦芽糊精2ml离心管中，加入1mlph4.5(20mm)的磷酸盐缓冲溶液，加入0.36u的α-cgtase，在60℃反应条件下反应12h；

(2)80℃水浴加热10min，使α-cgtase的酶活至0.003u；

(3)向反应体系中加入0.72u糖化酶，45℃的反应条件下反应12h，在100℃的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-α-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得产物进行分离纯化，最终得到0.44mg葡萄糖基-α-环糊精。

实施例2

一种酶法处理麦芽糊精制备葡萄糖基-β-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取50mg的麦芽糊精2ml离心管中，加入1mlph3.0(20mm)的磷酸盐缓冲溶液，加入0.36u的β-cgtase，在60℃反应条件下反应12h；

(2)90℃水浴加热5min，使β-cgtase的酶活至0.011u；

(3)向反应体系中加入0.72u糖化酶，45℃的反应条件下反应12h，在100℃的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-β-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得产物进行分离纯化，终得到0.56mg葡萄糖基-β-环糊精。

将本实施例中步骤(1)和(3)的样品进行高效液相分析测试，测试结果分别如图1、2所示。

由图1可以看出，以麦芽糊精为底物加入β-cgtase有葡萄糖基-β环糊精的生成，但产量仅有0.19mg，占主产物的比例仅为2.4％。

由图2为可以看出，以麦芽糊精为底物加入β-cgtase后，产物在β-cgtase和糖化酶的共同作用下，所得到的葡萄糖基-β环糊精的含量为0.42mg，占主产物的比例仅为24.0％。

实施例3

一种酶法处理麦芽糊精制备葡萄糖基-γ-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取50mg的麦芽糊精2ml离心管中，加入1mlph3.0(20mm)的磷酸盐缓冲溶液，加入0.36u的γ-cgtase，在60℃反应条件下反应12h；

(2)90℃水浴加热5min，使γ-cgtase的酶活至0.011u；

(3)向反应体系中加入0.72u糖化酶，45℃的反应条件下反应12h，在100℃的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-γ-环糊精的混合物；

(4)利用高效液相的方法对步骤(3)所得产物进行分离纯化，终得到0.37mg葡萄糖基-γ-环糊精。

实施例4

一种酶法制备单一麦芽糖基-α-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取0.1g通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含有麦芽糖、α-环糊精和麦芽糖基-α-环糊精的混合物，溶于300μlph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将上述溶液置于4℃条件下，低温结晶12h；

(3)将步骤(2)所得溶液在4℃条件下离心，取上清液加入600μlph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应体系中同时加入150μlcgtase和150μl糖化酶，45℃的条件下反应4h，即可得到麦芽糖基-α-环糊精、麦芽糖和葡萄糖的混合物；

(5)通过膜分离的方法对混合物进一步进行分离纯化，即可得所述麦芽糖基-α-环糊精。

实施例5

一种酶法制备单一麦芽糖基-β-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取0.1g通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含有麦芽糖、β-环糊精和芽糖基-β-环糊精的混合物，溶于300μlph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将上述溶液置于4℃条件下，低温结晶12h；

(3)将步骤(2)所得溶液在4℃条件下离心，取上清液加入600μlph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应体系中同时加入150μlcgtase和150μl糖化酶，45℃的条件下反应4h，即可得到麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖和葡萄糖的混合物；

(5)通过膜分离的方法对混合物进一步进行分离纯化，即可得所述麦芽糖基-β-环糊精。

将本发明实施例中步骤(3)和(4)的产物用高效液相进行分析测试，测试结果如图3所示，虚线酶处理前样品，实线为酶处理后样品。由图3可以看出，以普鲁兰酶逆向合成的含有麦芽糖、β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精混合物，在cgtase和糖化酶共同作用的条件下可以将β-环糊精水解掉，最终可得到含有麦芽糖基-β-环糊精、麦芽糖和葡萄糖的混合物，通过膜分离的方法即可得到麦芽糖基-β-环糊精。

实施例6

一种酶法制备单一麦芽糖基-γ-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取0.1g通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含有麦芽糖、γ-环糊精和麦芽糖基-γ-环糊精的混合物，溶于300μlph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将上述溶液置于4℃条件下，低温结晶12h；

(3)将步骤(2)所得溶液在4℃条件下离心，取上清液加入600μlph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应体系中同时加入150μlcgtase和150μl糖化酶，45℃的条件下反应4h，即可得到麦芽糖基-γ-环糊精、麦芽糖和葡萄糖的混合物；

(5)通过膜分离的方法对混合物进一步进行分离纯化，即可得到所述麦芽糖基-γ-环糊精。

实施例7

一种酶法制备单一半乳糖基-β-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取0.1g通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含有蜜二糖、β-环糊精和半乳糖基-β-环糊精的混合物，溶于300μlph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将上述溶液置于4℃条件下，低温结晶12h；

(3)将步骤(2)所得溶液在4℃条件下离心，取上清液加入600μlph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应体系中同时加入150μlcgtase和150μl糖化酶，45℃的条件下反应4h，即可得到半乳糖基-β-环糊精与蜜二糖和葡萄糖的混合物；

(5)通过膜分离的方法对混合物进一步进行分离纯化，即可得到所述半乳糖基-β-环糊精。

实施例8

一种酶法制备单一葡萄糖基-β-环糊精的方法，所述方法包括如下具体步骤：

(1)取0.1g通过普鲁兰酶逆向合成方法制备得到的含有麦芽糖、β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精的混合物，溶于300μlph4.5磷酸盐缓冲液中；

(2)将上述溶液置于4℃条件下，低温结晶12h；

(3)将步骤(3)所得溶液在4℃条件下离心，取上清液加入600μlph4.5缓冲溶液中，充分溶解；

(4)向反应液中加入100μl糖化酶，45℃的条件下反应10h，100℃条件下保温15min，可以得到含有麦芽糖、葡萄糖、β-环糊精和葡萄糖基-β-环糊精的混合物；

(5)向反应体系中同时加入150μlcgtase和150μl糖化酶，45℃的条件下反应4h，即可得到含有葡萄糖基-β-环糊精、葡萄糖和麦芽糖的混合物；

(6)通过膜分离的方法对混合物进一步进行分离纯化，即可得到所述葡萄糖基-β-环糊精。

将本发明实施例中步骤(4)和(5)的产物用高效液相进行分析测试，测试结果如图4所示，虚线酶处理前样品，实线为酶处理后样品。由图4可以看出，以普鲁兰酶逆向合成的含有麦芽糖、β-环糊精和麦芽糖基-β-环糊精混合物，在糖化酶的作用下得到麦芽糖、葡萄糖、β-环糊精和葡萄糖基-β-环糊精的混合物；在cgtase和糖化酶共同作用的条件下可以将β-环糊精水解掉，最终可得到含有葡萄糖基-β-环糊精、麦芽糖和葡萄糖的混合物，通过膜分离的方法即可得到葡萄糖基-β-环糊精。