一种利用木质素降解菌强化废弃生物质酸法预处理的方法与流程

技术领域：

本发明属于生物质新能源技术领域，具体涉及一种利用木质素降解菌强化废弃生物质酸法预处理的方法。

背景技术：
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近年来，为了降低对化石燃料的依赖，各国政府和科研机构大力开展对可再生能源的开发和研究。废弃生物质中的木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，蕴藏着巨量的碳资源，成为第二代生物质能源，是当前生物乙醇、生物塑料、生物柴油等绿色产品生物发酵最重要的碳源。木质纤维素中的半纤维素和木质素紧密镶嵌在纤维素的周围，如不进行任何处理，其糖化发酵效率极低。因此，预处理成为了木质纤维素开发利用的首要环节，即疏松或破坏纤维素的致密结构以及木质素和半纤维素的包裹，使纤维素、半纤维素和木质素分离，从而提高酶对纤维素的可及度和作用效率。

目前的预处理工艺主要分为物理法、化学法和生物法。酸法预处理是最常见的化学预处理方法之一，主要是指采用硫酸、盐酸或二氧化硫等酸性物质作用于木质纤维素中的木质素和半纤维素，从而达到暴露内部纤维素、提高酶解效率的目的，具有操作简单、效率高等优势。然而，由于木质素具有天然异质性、多变性和极强的稳定性，当酸性条件较温和时，木质素难以高效去除，这不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。但若改用较强的酸处理条件(如酸浓度高、温度高、作用时间长等)，又提高了技术的药耗和能耗，甚至易造成溶解木质素的重新凝聚，沉积在纤维素的表面。此外，较高浓度的酸的体系中还会产生大量的酶抑制产物。这都不利于后续的酶解过程。因此，温和的稀酸预处理是优选方案，但还需对这一方法进行改进，以深度去除预处理渣中残留木质素，从而提高木质纤维素中碳源利用和资源化产率。

目前，已有人采用真菌法或真菌-化学联合预处理实现了木质素的深度去除。但真菌生长所需时间过长(10天～50天)，不利于工艺扩大化和商业化。与真菌相比，木质素降解细菌的数量虽然较少，但可大大缩短生物处理接种时间(<7天)，因此采用细菌替代真菌进行木质纤维素预处理具有重要意义。但当前国内外尚无酸法-细菌联合预处理的相关报道。此外，废弃生物质也就是原生木质纤维素，不仅包括木质素，还包括纤维素和半纤维素，三者紧密结合连接；其中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用原生木质纤维素时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，因此，找寻合适的培养基成分以及条件，最大程度的去除酸法预处理渣中残留木质素也是亟待解决的问题。

技术实现要素：
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为了解决现有废弃生物质预处理技术存在的问题，本发明提供了一种利用木质素降解菌强化废弃生物质酸法预处理的方法。

本发明的技术方案为：

一种利用木质素降解菌强化废弃生物质酸法预处理的方法，包括以下步骤：

(1)酸法预处理：将粉碎的废弃生物质加入硫酸溶液中，加热反应，过滤分离，所得固体清洗至ph呈中性，烘干，得到酸法预处理废弃生物质；

(2)木质素降解菌强化预处理：将保藏编号为cgmccno.4240的木质素降解菌cupriavidusbasilensisb-8接种于含酸法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养后，过滤分离所得固体，清洗，烘干，得到细菌强化酸法预处理的废弃生物质。

步骤(1)所述的废弃生物质包括：水稻秸秆，玉米秸秆，小麦秸秆，甘蔗渣或柳枝稷等。

步骤(1)将废弃生物质粉碎后20-100目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

步骤(1)酸法预处理：将废弃生物质按固液比为1:10-1:20(g/ml)加入浓度为0.5-2.0％的硫酸溶液中，静置于110-130℃恒温环境反应20～40min，过滤分离，所得固体用超纯水清洗至ph呈中性，烘干至恒重，得到酸法预处理废弃生物质。

步骤(2)木质素降解菌强化预处理：将木质素降解菌接种于含酸法预处理废弃生物质的无菌培养基中，培养1-3天后，过滤分离所得固体，用超纯水清洗3次，烘干至恒重，得到细菌强化酸法预处理的废弃生物质。

步骤(2)所述木质素降解菌培养条件为接种量5-15％(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，温度25-40℃，自然ph条件，培养时间1-3天。

步骤(2)所述的含酸法预处理废弃生物质的无菌培养基为：酸法预处理废弃生物质5～15g/l，(nh4)2so42g/l，k2hpo41g/l，kh2po41g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，cacl20.01g/l，feso4·7h2o0.015g/l，mnso4·h2o0.01g/l。

本发明提供的预处理方法的优势在于：

(1)利用木质素降解菌预处理可实现酸法预处理废弃生物质中木质素和半纤维素的深度去除，同时破坏木质纤维素结构，使木质纤维素结构变得松散多孔，大大增加了酶解糖化时的可及表面。

(2)由于木质素具有天然异质性、多变性和极强的稳定性，当酸性条件较温和时，木质素难以高效去除，这不仅降低了糖纯度，也给纤维素的后续酶解和生物转化造成阻碍。但若改用较强的酸处理条件(如酸浓度高、温度高、作用时间长等)，又提高了技术的药耗和能耗，甚至易造成溶解木质素的重新凝聚，沉积在纤维素的表面。此外，较高浓度的酸的体系中还会产生大量的酶抑制产物。这都不利于后续的酶解过程。因此，温和的稀酸预处理是优选方案，但还需对这一方法进行改进，本发明则很好的解决了这个问题。

(3)废弃生物质中的原生木质素高度聚合，木质素降解细菌作用时比纯的碱木质素要更加复杂，作用难度更大，本发明找寻了合适的培养基成分以及条件，最大程度的改善了废弃生物质的预处理效果。

(4)能够大幅提高酶解糖化效率，相比于未经预处理的木质纤维素，酶解效率可比传统酸法预处理提高了约60％。

(5)具有反应条件温和、操作简单、二次污染小、处理时间短、成本低廉等优点。

本发明所使用的木质素降解菌(cupriavidusbasilensisb-8)，保藏编号cgmccno.4240，是由本申请人筛选的已经做过专利保藏和专利申请的菌株。

附图说明:

图1：实施例中预处理后木质纤维素糖产量变化；

图2：实施例中预处理后木质纤维素各组分变化；

图3：实施例中预处理的木质纤维素预处理前后扫描电镜分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

实施例1

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆置于适当大小容器中，按固液比为1:10(g/ml)分别加入浓度为0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的硫酸溶液，并分别静置于121℃恒温环境中20、30和40min后，过滤分离得到湿渣a。

(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣a，直至冲洗液ph呈中性，置于60℃烘干至恒重得干渣b。

(4)将保存在lb斜面的b-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h(即600nm处光密度达到0.8-1.0)，得到b-8的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(5)将上一步所得到的b-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(6)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按10％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于干渣b培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣c；其中所述干渣b培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4·7h2o0.015g，mnso4·h2o0.01g，蒸馏水1l；

(7)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣c，置于60℃烘干至恒重得到干渣d；

(8)将干渣d按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到高纯度糖。

实施例中各个反应条件后的酶解效率如图1所示，可以看出，木质素降解菌cupriavidusbasilensisb-8处理后，其酶解效率普遍高于未处理(虚线)和单独酸法预处理，最大可将单独酸法(是指本发明的低强度酸法，而非高强度酸法)预处理的酶解效率提高62％，效果显著。从组分测定结果来看(图2)，cupriavidusbasilensisb-8的处理可去除废弃生物质中的半纤维素和木质素。另外，cupriavidusbasilensisb-8处理后废弃生物质的表面形态发生了明显变化，如图3所示。未处理时表面光滑致密，酸法预处理后形成了大量的纤维素沉积物，这两种形态都不利于后续的酶解，而cupriavidusbasilensisb-8处理后，原来的致密性结构被彻底破坏，表面变得十分疏松多孔，内部纤维素被充分暴露，这大大增加了后续酶解过程中酶的可及表面，从而显著提高了预处理效率。

对比例1

对比例1仅采用酸法处理水稻秸秆。具体反应条件为：

(1)将水稻秸秆粉碎后过筛，烘干至恒重。

(2)将水稻秸秆置于适当大小容器中，按固液比为2:100(g/ml)分别加入至浓度为1.0％的硫酸溶液，并静置于120℃恒温环境中60min后，过滤分离得到湿渣a。

(3)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣a，直至冲洗液ph呈中性，烘干至恒重得干渣b。

(4)将干渣b按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。

对比例1的酸法预处理后水稻秸秆的酶解效率是未处理的约3倍。

本发明实施例1中，当酸液浓度(1.0％)和反应温度(121℃)，缩短了反应时间至20-40min，并提高了木质纤维素和酸液的固液比(1:10g/ml)，b-8强化酸法预处理所得木质纤维素的酶解效率是未处理的3.2-3.4倍，略高于对比例1中的效果。以上结果说明本发明不仅可降低酸法预处理的反应强度，降低了药耗和能耗，而且对木质纤维素的酶解效率的提高也有一定的改善。

对比例2

对比例2采用真菌-酸法对水稻秸秆进行预处理，具体过程及反应条件为：

(1)将水稻秸秆粉碎后过筛，烘干至恒重。

(2)按固液比为1:10(g/ml)分别加入至浓度为2.5～4.5％(体积分数)的硫酸溶液，并静置于121℃恒温环境中60min后，过滤分离得到湿渣，用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，直至冲洗液ph呈中性，烘干至恒重。

(3)将4株木质素降解真菌(phanerochaetechrysosporium,pycnoporuscinnabarinus,rck-1,rck-3)在最优生长条件下以步骤(2)得到的水稻秸秆作为碳源进行预处理，预处理时间为10d，用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的真菌处理后的水稻秸秆，并烘干至恒重得到干渣；

(4)将干渣按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。

以上条件预处理后水稻秸秆的酶解效率最高仅能达到未处理水稻秸秆的约1.3倍。

本发明实施例1中采用的硫酸浓度(0.5-2.0％)低于对比例2，且酸处理时间(20-40min)和生物作用时间(3d)均缩短，cupriavidusbasilensisb-8强化酸法预处理所得木质纤维素的酶解效率是未处理的2.7-3.4倍，远高于对比例2的结果，说明本发明的细菌强化酸法预处理技术与当前真菌-酸法预处理技术相比，在预处理效果、预处理时间、药耗和能耗等方面均具有较大优势。

对比例3

本对比例3中采用的木质纤维素预处理方法，仅包括本发明细菌cupriavidusbasilensisb-8预处理过程，具体步骤如下：

(1)将水稻秸秆粉碎后60目过筛，超纯水清洗两遍，于60℃烘干至恒重得到干渣b。

(2)将保存在lb斜面的cupriavidusbasilensisb-8菌体接种于lb液体培养基中，于30℃温度下，培养18h，得到cupriavidusbasilensisb-8的种子液；其中所述lb液体培养基各成分配比为：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1l；所述lb斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；

(3)将上一步所得到的cupriavidusbasilensisb-8种子液在12000rpm条件下离心5分钟，弃去上层清液，收集菌体；

(4)将收集的cupriavidusbasilensisb-8菌体按20％接种量(移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例)，接种于水稻秸秆培养基中，于30℃温度下，自然ph，培养3天，过滤分离得湿渣；其中所述水稻秸秆培养基各成分配比为：干渣b10.0g，k2hpo41.0g，(nh4)2so42.0g，kh2po41.0g，mgso40.2g，cacl20.01g，feso4·7h2o0.015g，mnso4·h2o0.01g，蒸馏水1l；

(5)用蒸馏水反复冲洗过滤分离得到的湿渣，置于60℃烘干至恒重得到干渣c；

(6)将干渣c按固液比1:40(g/ml)加入50mm柠檬酸缓冲液(ph＝4.8)及纤维素酶12pfu/g(水稻秸秆干重)，在50℃条件下，酶解24h，得到糖。

经本对比例预处理后的水稻秸秆的还原糖产量约为150mg/g，略高于未处理水稻秸秆(131mg/g)，但远远低于实施例1中的还原糖产量(352-443mg/g)。说明单独采用cupriavidusbasilensisb-8预处理未能达到理想效果。而本发明在酸法预处理的基础上，通过cupriavidusbasilensisb-8的作用产生了意想不到的效果。

对比例4

本对比例中采用的木质纤维素预处理方法与实施例中的过程相同，仅将实施例步骤(6)中的大部分培养基成分改为与专利(申请号：201610569477.0)相同，以本发明实施例制备的干渣b10.0g/l，代替碱木质素1-6g，其他组分为：(nh4)2so40.28g，k2hpo41g，mgso40.2g，cacl20.1g，feso40.05g，mnso40.02g，kh2po41g，蒸馏水1000ml。结果发现，利用专利(申请号：201610569477.0)中的培养基条件后，细菌生物量显著减少，预处理后的水稻秸秆的酶解效果仅约为实施例中的1/2。对比说明本发明经过培养基成分和条件的筛选，得到了适合于本发明废弃生物质预处理的培养基成分和方法。