本发明涉及生物化学工程领域，尤其涉及一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法。
背景技术：
咪唑-4-乙酸(imidazole-4-aceticacid,iaa)是一种重要的咪唑衍生物。它是中枢神经系统内主要抑制性神经递质γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，gaba)的构象限制性类似物，具有安眠、降压和抗氧化等药理作用。与此同时，咪唑-4-乙酸也被用来合成蛋白酶抑制剂、孕尿翳受体抗结剂、以及抗癌化合物等。此外，iaa还可以通过其自身的羧基基团、咪唑基团与过渡态金属形成配位化合物。最近，iaa也被用来制备咪唑修饰的壳聚糖纳米颗粒，而这种颗粒被认为是良好的sirna药物载体。
目前，商业化的iaa都是通过化学合成法制备获得；例如：α-羟基-β-咪唑基-4丙酸氧化法(knoop,beitraegezurchemischenphysiologieandpathologie,1907,10,119；pymanf.l.,anewsynthesisof4(or5-)-β-aminoethylglyoxaline,oneoftheactiveprinciplesofergot.journalofthechemistrysocietytransactions,1911,99:668)和4-腈甲基咪唑水解法(pymanf.l.,anewsynthesisof4(or5-)-β-aminoethylglyoxaline,oneoftheactiveprinciplesofergot.journalofthechemistrysocietytransactions,1911,99:668)等。但是，上述化学合成法的反应条件苛刻、原料成本高、产物复杂且环境污染大。
因此，开发高效、低成本且环境友好的iaa制备方法具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明针对上述现有技术中的不足，提供一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法，该方法反应条件温和、无需使用有机溶剂和有毒试剂且底物转化率高。
本发明提供了一种咪唑-4-乙酸的生物合成方法，包括以下步骤：
(1)以l-组氨酸为底物，在膜联l-氨基酸脱氨酶的催化下，进行脱氨反应，得到含有中间产物3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的反应液；
(2)向所述反应液中加入过氧化氢溶液，进行反应，反应结束后，得到咪唑-4-乙酸。
上述生物合成过程如式(1)所示：
在于自然界中，氨基酸脱氨酶主要以分泌型形式存在，而来源于proteus,providencia,morganellas等细菌的氨基酸脱氨酶则是与细胞膜进行偶联。与分泌型l-氨基酸脱氨酶相比，膜联l-氨基酸脱氨酶具有易于异源表达，不产生对细胞和酶有毒产物的特点，更适于工作催化的应用。
作为优选，所述膜联l-氨基酸脱氨酶的氨基酸序列的登陆号为baa90864。该膜联l-氨基酸脱氨酶来源于普通变形杆菌iam12003(proteusvulgarisiam12003)，其序列登陆号为baa90864，该特定序列的酶对于侧链集团较大的氨基酸如组氨酸、酪氨酸和异亮氨酸等具有较好的催化活力。该基因序列可以通过pcr扩增得到或者化学合成得到。
进一步地，所述脱氨反应中的催化剂为表达膜联l-氨基酸脱氨酶的工程菌。膜联氨基酸脱氨酶必须与细胞膜偶联才能发挥其完整催化效力，如果离开细胞膜游离表达便会丧失部分功能。
本发明通过常规的基因工程技术先合成普通变形杆菌iam12003(proteusvulgarisiam12003)的l-氨基酸脱氨酶的基因序列，再将合成的基因连入表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转入宿主细胞中，得到所述工程菌。
进一步地，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌；其中，所述大肠杆菌可以为大肠杆菌(e.coli)bl21、大肠杆菌(e.coli)blr、大肠杆菌(e.coli)origami、大肠杆菌(e.coli)、bl21plyss、大肠杆菌(e.coli)novablue或大肠杆菌(e.coli)rosetta。
更进一步地，所述工程菌的宿主细胞为大肠杆菌rosstta(de3)。通过对比转化有pet28-laad的不同大肠杆菌如bl21(de3)，origami(de3)等的催化活力，发现以大肠杆菌rosstta(de3)为宿主的重组工程菌表达活性较高。所述表达载体可以为pet-28a、pet-29、pet-30、pet-32、prset等。更优选，所述表达载体为pet28a。
进一步地，以细胞干重计，反应液中所述工程菌的密度为0.1～1.5g/l，底物浓度为10～150mm；进一步地，所述底物浓度为50～100mm。
作为优选，所述脱氨反应的ph值为6.0～11.0；更优选，所述ph值为8.0。
作为优选，所述脱氨反应的温度为10～60℃；更优选，所述温度为30～45℃。
进一步地，步骤(2)中，所述过氧化氢在反应液的終浓度为0.1～2％，反应时间为1～60min。更优选，所述过氧化氢在反应液的終浓度为1％，反应时间为10min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的咪唑-4-乙酸的生物合成方法，该方法通过膜联l-氨基酸脱氨酶和过氧化氢的连续作用，将组氨酸转化为咪唑-4-乙酸。本发明方法步骤简单，反应条件温和，原料来源广泛、生物催化剂易于制备、设备要求低，底物转化率高，且不需要使用有机溶剂和有毒试剂，相对于现有的化学法具有高效、成本低和环境友好的特点。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1膜联l-氨基酸脱氨酶工程菌的构建
根据普通变形杆菌iam12003膜联l-氨基酸脱氨酶的基因序列(其序列登陆号为baa90864)，进行全基因合成，通过bamhi和xhoi的酶切位点，将合成基因(laad)连入pet20(b)+中，转化大肠杆菌dh5α菌株，筛选阳性克隆，得到重组质粒pet20b-laad。此外，通过ncoi和bamhi的酶切位点，将laad基因连入pet28a(+)中，转化大肠杆菌dh5α菌株，筛选阳性克隆，得到重组质粒pet28a-laad。
将两种重组质粒转化rosstta(de3)，其中rosstta(de3)/pet20b-laad表达的laad带有pelb信号肽，采用保守分泌途径(conservedsecretorypathway)进行细胞周质表达，而rosstta(de3)/pet28a-laad采用自身带有的双精氨酸转运信号肽(twin-argininetranslocationpathway)进行细胞周质表达。发现两种重组菌的催化活力相当，但rosstta(de3)/pet28a-laad的可以获得更高的生物量。将重组质粒pet28a-laad用常规方法转化入其它大肠杆菌表达系统如大肠杆菌bl21(de3)、bl21(de3)plyss等。其中以大肠杆菌rosstta(de3)为宿主的重组工程菌表达活性较高。
实施例2利用膜联l-氨基酸脱氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸
具体步骤如下：
(1)从活化的lb固体培养基上挑取工程菌(e.colirosstta(de3)/pet28a-laad，单克隆菌体接入含卡那霉素(50μg·ml-1)的lb液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，获得种子液。
(2)将种子液按体积分数2％接种量接种到含有卡那霉素(50μg·ml-1)的lb培养基，置于37℃，200r/min培养至od6000.6时，加入iptg，使iptg终浓度为0.5μm，30℃，150r/min诱导培养6h。
(3)离心收集工程菌菌体，弃上清，用0.2mm磷酸缓冲液(ph7.5)清洗菌体。将清洗后的工程菌加入到含50mml-组氨酸的磷酸缓冲液(0.2mm，ph7.5)中，溶液中菌体的密度为0.5g/l(细胞干重)。将反应液置于37℃，200r/min的条件下培养15h，待l-组氨酸完全转化，获得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。
(4)向制备的3-(4-咪唑)-2-氧丙酸溶液中加入终浓度为1％的h2o2，反应10min，得到含量为22.3mm的咪唑-4-乙酸溶液，组氨酸到咪唑-4-乙酸的转化率达46％。
实施例3利用膜联l-氨基酸脱氨酶工程菌合成咪唑-4-乙酸
将实例2步骤(3)中反应液的l-组氨酸浓度调整为100mm，其它条件不变。37℃，200r/min的条件下培养37h，获得含有3-(4-咪唑)-2-氧丙酸的溶液。向该溶液中加入1％的h2o2，反应10min，得到含量为35.6mm的咪唑-4-乙酸溶液，组氨酸到咪唑-4-乙酸的转化率达37％。