本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用金针菇制备降血糖肽的方法。
背景技术：
目前，糖尿病已成为继肿瘤、心血管疾病之后严重威胁人类健康的慢性病，是威胁人类健康的三大慢性疾病之一，餐后高血糖是糖尿病的主要风险因子，α－葡萄糖苷酶抑制剂能通过抑制小肠上皮绒毛膜刷状缘上α－葡萄糖苷酶的活性，减少食物中碳水化合物的消化，延缓葡萄糖的生成，在降低餐后血糖中具有重要作用。目前用于临床治疗的α-葡萄糖苷酶抑制剂，多为化学合成，长期使用对人体能产生一定的副作用，如损害肝脏，导致胃肠气胀和肠功能紊乱等。
生物活性肽是源于蛋白质的多功能化合物，在生命活动中起着重要的调节作用，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血压、降血脂、降血糖等作用，并具有易消化、安全性高的特点，是极具发展前景的功能因子。从天然蛋白中提取制备具有营养性和生理活性的功能肽，能够有效的提高富含蛋白的食品及农产品附加值。
金针菇不仅味道鲜美，同时具有一定的保健功能，经常食用可以提高智力，抗疲劳，抗菌消炎等作用。金针菇富含锌、钾，钾可以控制血糖的升高，锌可以增加胰岛素原转化为胰岛素的能力，加强机体对葡萄糖的利用，抑制血糖的升高。金针菇也可抑制血脂升高，降低胆固醇，防治糖尿病心脑血管疾病，降低糖尿病并发疾病的发病率。
我国是金针菇生产和消费大国，随着金针菇工厂化生产的普及，金针菇的产量增多，但金针菇深加工技术落后，缺乏高附加值的产品，不利于金针菇产业健康可持续发展。金针菇蛋白质含量高，氨基酸含量非常丰富，目前关于金针菇蛋白酶解制备生物活性肽的研究不多，有研究采用金针菇制备抗菌肽。
201610381719.3的发明《一种金针菇提取物及其制备方法与应用》告知了一种金针菇提取物的制备方法，金针菇以水提、醇沉制得金针菇提取物；该金针菇提取物中主要包括多糖、蛋白质、维生素和矿物质。经体外实验证明，该金针菇提取物能抑制体外α糖苷酶的活力。体内试验表明，金针菇提取物可以明显降低2型糖尿病大鼠的血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗，降低血清游离脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原储备，修复受损胰腺，有明显的治疗2型糖尿病作用。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、效果好的利用金针菇制备降血糖肽的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用金针菇制备降血糖肽的方法，包括以下步骤：
1)、将含水量≤15％的金针菇干粉(能过60目的筛)与质量浓度为0.4％～0.6％的氢氧化钠水溶液按1：11～13的重量比混合(金针菇干粉被溶解)后，50～70℃水浴1.5～2.5h，取上清液，调节上清液ph值至4±0.5；将调节ph值后的上清液冷冻离心，得沉淀(为金针菇蛋白沉淀)；
2)、将步骤1)所得的沉淀与水按照1:3～5的重量比混合后，调节ph值至7～7.5，然后升温至45～50℃，再加入沉淀重量1％的中性蛋白酶于震荡条件进行酶解反应，酶解温度为45～50℃，酶解反应时间为3～4h；
3)、将步骤2)所得的酶解反应产物于5～10min内升温至95～100℃，保温10～15min，然后自然冷却至室温，离心，得酶解液；
4)、将步骤3)所得的酶解液于0.1～0.2mpa的工作压力和20～45℃的工作温度下，采用超滤膜进行超滤处理，得到超滤酶解液，所述超滤膜的截留分子量为3kda；
5)、将超滤酶解液进行喷雾干燥，得金针菇降血糖肽粉。
作为本发明的利用金针菇制备降血糖肽的方法的改进：步骤2)中：中性蛋白酶的酶活力为100u/mg；震荡频率为150～200r/min。
作为本发明的利用金针菇制备降血糖肽的方法的进一步改进：所述步骤1)中的冷冻离心为：将调节ph值后的上清液在3～5℃的温度下于7000～9000r/min离心10～20min。
作为本发明的利用金针菇制备降血糖肽的方法的进一步改进：所述步骤3)的离心为：在3～5℃的温度下于2500～3500r/min离心15～25min，所得的上清液即为酶解液。
作为本发明的利用金针菇制备降血糖肽的方法的进一步改进：所述步骤5)的喷雾干燥为：进风温度控制在170～190℃(较佳为180℃)，出风温度控制在90～100℃(较佳为95℃)。
作为本发明的利用金针菇制备降血糖肽的方法的进一步改进：
所述步骤1)中，将金针菇干粉与质量浓度0.5％的氢氧化钠水溶液按1：12的重量比混合后，60℃水浴2h，取上清液，调节上清液ph值至4，然后4℃、8000r/min下离心15min，得沉淀。
在本发明中，室温一般指10～30℃。
本发明的利用金针菇制备功能肽(降血糖肽)的方法，具有如下技术优势：
1、本发明所制备的金针菇功能肽是经生物酶水解而得，具有强抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用，对高血糖患者具有辅助治疗作用，安全、无毒副作用。
2、本发明以金针菇原料，经过本发明的技术转化，可以有效提高金针菇产品的利用价值，对继续促进农业提质增效具有重要意义。
3、本发明方法通过最佳制备工艺条件的选择，得出的最佳制备方法，并通过超滤膜处理技术，最大限度选择了具有优异活性的肽段，有效增强了活性肽的含量。
4、本发明的产品可以作为药品、保健食品、食品、食品添加剂、药物增效剂等，工艺科学合理，操作简单，具有较强的工业实施性。
本发明的金针菇降血糖肽的服用方式为口服，用量约为4～5g/天.人。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下案例中的金针菇干粉含水量≤15％，能过60目的筛。
实施例1、一种利用金针菇制备降血糖肽的方法，依次进行以下步骤：
1)、称取金针菇干粉2kg，加24kg的0.5％的氢氧化钠水溶液混合后，60℃提取2h，取上清液，用1mol/l的hcl调节上清液ph值至4.0，8000r/min冷冻(4℃)离心15min，得沉淀0.5kg，
2)、在步骤1)所得沉淀中加水1.5kg并搅拌均匀，利用0.1mol/l的氢氧化钠调节ph值为7.0，升温至45℃，然后加入中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，于震荡条件下(180r/min)45℃酶解反应3h；
3)、将步骤2)所得的酶解反应产物于10min内升温至95～100℃，保持此温度15min，自然冷却至室温，采用j-6m型大容量冷冻离心机(beckman公司)在转速3000r/min及4℃条件下离心20min，所得的上清液即为酶解液。
4)、将所述酶解液在0.1～0.2mpa的工作压力和20～45℃的工作温度下，采用超滤膜进行超滤处理，得超滤酶解液，该超滤膜截留分子量为3kda。
5)、将超滤酶解液喷雾干燥(喷雾干燥的工艺参数为：进风温度控制：180℃，出风温度控制：95℃)，即得金针菇降血糖肽。
该金针菇降血糖肽粉，色泽微黄。将该肽粉配置成3mg/ml的溶液，测得对a-葡萄糖苷酶的抑制活性为60.2％。
备注说明：对a-葡萄糖苷酶的抑制活性的检测方法为(此为常规技术)：
分别取50μl一定浓度的酶解肽溶液(0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液配置)，100μl10mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液(用0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液配制)，加入酶标板中，混匀后，25℃下放置10min。然后加入50μl5mmol/l的pnpg(对硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷)溶液(用0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液配制)，37℃下培养30min后，加入50μl0.67mol/l的na2co3溶液终止反应，测定405nm下吸光度。该体系称为样品。
同时设置以下3个体系：对照、样品空白、和对照空白。
对照：以50μl0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液替代50μl的酶解肽溶液。
样品空白：以100μl的0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液代替100μl10mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液；
对照空白：分别以相应体积量的0.1mol/l，ph＝6.9磷酸缓冲液代替酶解肽溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，抑制率按下式计算。
实施例2、一种利用金针菇制备降血糖肽的方法，依次进行以下步骤：
1)、称取金针菇干粉5kg，加60kg的0.5％的氢氧化钠水溶液混合后，60℃提取2h，取上清液，用1mol/l的hcl调节上清液ph值至4.0，8000r/min冷冻(4℃)离心15min，得沉淀1.3kg；
2)、在步骤1)所得沉淀中加水6.5kg并搅拌均匀，利用0.1mol/l的氢氧化钠调节ph值为7.5，升温至50℃，然后加入中性蛋白酶(100u/mg)13.0g，于震荡条件(180r/min)下50℃酶解反应4h；
后续步骤同实施例1。
所得的金针菇降血糖肽粉，色泽微黄。配置成3mg/ml的溶液，测得对a-葡萄糖苷酶的抑制活性为62.1％。
对比例1、将实施例1步骤2)中的中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，改为酸性蛋白酶(50u/mg)5g，将调节ph值为7.0相应改为调节ph值为4，其余等同实施例1。所得结果：
该肽粉配置成3mg/ml的溶液，测得对a-葡萄糖苷酶的抑制活性为9.8％。
对比例2、取消实施例1步骤1)中的“用1mol/l的hcl调节上清液ph值至4.0”，即，将上清液直接进行8000r/min冷冻离心15min；
其余内容等同于实施例1。
所得结果：离心后，基本无沉淀，无法进行后续相应酶解实验。
对比例3-1、将实施例1步骤1)中的氢氧化钠水溶液的重量由24kg改成30kg；其余内容等同于实施例1。
步骤1)所得沉淀为0.46kg。
对比例3-2、将实施例1步骤1)中的氢氧化钠水溶液的重量由24kg改成15kg；其余内容等同于实施例1。
步骤1)所得沉淀为0.43kg。
对比例4、将实施例1步骤2)中的中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，改为酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶(1：1)10g，将调节ph值为7.0相应改为调节ph值为6，将酶解温度45℃改为58.62℃。其余等同实施例1。
该肽粉配置成3mg/ml的溶液，测得对a-葡萄糖苷酶的抑制活性为12.6％。
最后，还需要注意的是以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。