一种检测内质网中硫化氢的荧光探针的制作方法

本发明涉及一种检测环境和生物体内内质网中硫化氢的荧光探针，属于有机小分子荧光探针技术领域。

背景技术：

硫化氢(h2s)是一种具有臭鸡蛋气味儿的无色气体。一直以来被大家公认为是一种化学污染物，长期接触硫化氢会造成呼吸系统损伤，过度吸入硫化氢气体会使人丧失意识、休克、甚至死亡。但医学研究发现，硫化氢在生物体新陈代谢，尤其是在心血管系统、神经系统中发挥着重要的生理功能，继一氧化碳(co)、一氧化氮(no)之后，成为了第三种重要的内源性气体信号分子。内源性硫化氢是由生物体内含硫氨基酸(主要是半胱氨酸)经酶促反应或者含硫化合物在体内代谢产生的。内源性硫化氢参与着体内重要的生理调节功能，例如血管舒张、细胞凋亡、神经传导等。同时作为一种还原性物质，硫化氢以抗氧化剂的形式清除体内活性氧物种，调节体内氧化还原平衡。此外，硫化氢的浓度异常还与一些重大疾病息息相关，例如：肺动脉高压、糖尿病、阿兹海默症等。尽管硫化氢在体内生理功能呈现多样化状态，但是其在体内的生理功能仍然不是很明确，因此，在复杂的生物系体系中对硫化氢生理功能的检测具有十分重要的科研价值。

内质网是真核细胞内特有的单层膜细胞器，它具有管状结构和片状结构两种形态，两种形态彼此闭合连通。内质网遍布整个细胞质内，连接核膜和细胞膜，在两者之间进行物质运输和信号传递。内质网的主要功能是负责蛋白质合成、加工与修饰。因此，检测内质网的硫化氢浓度变化，对研究内质网中硫化氢的生理功能具有重要意义。

目前，国内外已报道的硫化氢检测方法主要有比色法、电化学分析、气相色谱法和硫化物沉淀等，然而，这些技术不能实现时间和空间监测硫化氢的瞬态反应，并且在样品制备加工过程中操作繁琐，需要对细胞和组织样品进行不可修复的破坏。相比之下，荧光探针成像方法是非常可取的，它对靶标分子具有高灵敏度和高选择性，并且能够实现对靶标分子的实时成像。因此，发展一种简单快捷、灵敏、高效的测试硫化氢含量的方法尤为重要。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种检测硫化氢的荧光探针(na-er-h2s)。本发明探针通过荧光成像技术可用于检测细胞内内质网中的硫化氢。

本发明所述的检测硫化氢的荧光探针，该荧光探针命名为4-叠氮基-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺，简称na-er-h2s，其化学结构式如式()所示：

（）

上述na-er-h2s的制备反应式如下：

。

上述检测甲醛的荧光探针(na-er-h2s)的制备方法是：

制备化合物(3)：在圆底烧瓶中，加入适量二氯甲烷和乙二胺(1)，0℃搅拌下加入对甲苯磺酰氯(2)，而后升温到室温搅拌得到化合物n-(2-氨基乙基)-4-甲基本磺酰胺(3)。

制备化合物(5)：在圆底烧瓶中，加入4-溴-1,8-萘二甲酸酐(4)，加入适量乙醇作为溶剂，搅拌下加入n-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺(3)，加热回流生成4-溴-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)。

制备na-er-h2s(7)：在圆底烧瓶中，加入4-溴-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)，加入适量dmf作为溶剂，搅拌状态下加入叠氮化钠(6)，加热搅拌生成化合物4-叠氮基-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)，简称：na-er-h2s。

本发明所述的硫化氢荧光探针na-er-h2s用于检测环境和生物体内中硫化氢含量。

如上所述荧光探针na-er-h2s能灵敏的专一识别硫化氢，并通过抑制d-pet效应增强荧光的方式来实现对硫化氢的识别。

本发明所述检测硫化氢的荧光探针na-er-h2s本身没有荧光信号，这是由于叠氮基团本身作为一个强吸电子基团，对整个萘酰亚胺荧光团产生d-pet效应，使得整体分子的荧光信号被淬灭。当探针与硫化氢相互作用后，硫化氢作为强还原试剂，将叠氮基团还原为氨基，使得其d-pet效应消失，而反应后的整体分子因为产生了ict效应而产生强烈的荧光信号。

识别机理如下：

。

本发明提供的硫化氢荧光探针属小分子类荧光探针，目前针对内质网靶向的硫化氢荧光探针并未有报道，因此具有很重要的研究价值。

通过光谱实验和成像实验得出结论，本发明提供的检测硫化氢的荧光探针溶液，起初没有荧光信号，当向其加入硫化钠(硫化氢释放试剂)后荧光信号显著增强，该结果及其现象为检测环境中的硫化氢和硫化氢生物学成像应用奠定了理论基础，预示其在检测环境中的硫化氢和硫化氢生物标记领域具有潜在的应用价值。同时，利用本发明的探针通过荧光成像技术检测硫化氢可于评价和研究细胞中内质网的硫化氢的浓度变化，对研究细胞内质网中硫化氢的生理功能有潜在的指导意义。

附图说明

图1：探针na-er-h2s的核磁谱图（氢谱和碳谱）；

图2：探针na-er-h2s的紫外吸收光谱；探针浓度：5μm，硫化钠浓度：200μm。测试时间：30min；

图3：探针na-er-h2s对硫化氢的选择性检测；其中，激发波长为445nm；探针的浓度：5μm，测试离子以及氨基酸的浓度为5mm，活性氧的浓度为100μm。加入的离子分别为：探针本身、半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、氟化钾、碘化钾、氯化镁、硫代硫酸钠、溴化钠、次氯酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、叠氮化钠、亚硝酸钠、硝普酸钠(no)、抗坏血酸、氯化锌、过氧化叔丁醇、过氧化叔丁基、柠檬酸钠、硫化钠。由图可见，该荧光探针能够专一性识别硫化氢；

图4：探针na-er-h2s与硫化氢作用的滴定实验；其中，探针浓度为5μm，硫化钠溶液浓度分别为：0-500μm，激发波长为445nm，最带发射波长为543nm。作用时间30min;

图5：探针na-er-h2s与硫化氢相互作用的动力学实验；探针浓度为5μm，硫化钠溶液浓度从低到高依次为为：1-500μm，激发波长为445nm，测试时间：1h；

图6：探针na-er-h2s的外源性硫化氢细胞成像实验；激发波长：488nm，发射波段：500-550nm。其中：a)hela细胞的明场图；b)hela细胞的荧光图；c)为a和b的叠加图；d)hela细胞与探针共孵育的明场图；e)hela细胞与探针共孵育的荧光图；f)为d和e的叠加图；g)hela细胞与探针和硫化钠共孵育的明场图；h)hela细胞与探针和硫化钠共孵育的荧光图；i)为g和h的叠加图；标尺：20μm；

图7：探针na-er-h2s的共定位细胞成像实验。；激发波长：488nm(绿色通道)和561nm(红色通道)，发射波段：500-550nm和625–675nm。a)hela细胞与内质网红色定位染料、探针和硫化钠共孵育的明场图；b)hela细胞与内质网红色定位染料、探针和硫化钠共孵育的绿色荧光图；c)hela细胞与内质网红色定位染料、探针和硫化钠共孵育的红色荧光图；d)hela细胞与内质网红色定位染料、探针和硫化钠共孵育的荧光叠加图；e)共定位图片。标尺：20μm。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制，实施例中化合物的号码对应上述方案中化合物的号码。

实施例1

化合物n-(2-氨基乙基)-4-甲基本磺酰胺(3)的合成：

；

在0℃下，在100ml圆底烧瓶中加入10mmol乙二胺(1)和20ml二氯甲烷，搅拌下加入30mmol三乙胺，得到的溶液搅拌10min后，再滴加5mmol对甲苯磺酰氯(2)的二氯甲烷溶液(3ml)。而后升温至室温搅拌10-12小时。接着向反应中加入20ml10%的碳酸钠水溶液淬灭反应，再向反应体系中补加20ml二氯甲烷，整个反应体系使用水洗3次后，有机相使用无水硫酸镁干燥。减压蒸除二氯甲烷，得到白色粉末粗产物，经柱色谱分离(石油醚/二氯甲烷=50:1到10:1)后，使用乙醇重结晶得到白色固体产物n-(2-氨基乙基)-4-甲基本磺酰胺(3)。产率：63%。

化合物4-溴-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)的合成：

；

在10ml的圆底烧瓶中，加入1mmol4-溴-1,8-萘二甲酸酐(4)和4ml乙醇，搅拌下化合物1.3mmoln-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺(3)，反应体系加热回流3小时后，冷却到室温，减压过滤，滤饼用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到灰白色化合物4-溴-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)。产率：79%。产物不经过纯化，直接进行下一步反应。

化合物4-叠氮基-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)的合成：

；

在10ml圆底烧瓶中，加入0.5mmol4-溴-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(5)，和1mmol叠氮化钠(6)，再加入3mldmf，50℃加热10-12小时后，冷却至室温，加入50ml蒸馏水后，使用二氯甲烷萃取，有机相使用无水硫酸镁干燥。减压蒸馏除去有机试剂后，粗产物柱色谱分离，淋洗剂为二氯甲烷/甲醇=30:1。得到淡黄色4-叠氮基-n-(2-氨基乙基-4-甲基苯磺酰胺基)萘酰亚胺(7)。产率：57%。探针na-er-h2s的核磁谱图如图1所示。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.15(s,1h),8.58(d,j=8.0hz,1h),8.53(d,j=8.0hz,1h),8.50(d,j=8.0hz,1h),7.79(t,j=7.6hz,1h),7.66(d,j=8.0hz,2h),7.50(d,j=8.0hz,1h),6.89(d,j=8.0hz,2h),5.18(t,j=4.0hz,2h),4.29(t,j=5.6hz,2h),3.50(q,j=5.6hz,2h),2.00(s,3h).

实施例2

硫化氢荧光探针na-er-h2s与硫化氢相互作用的紫外-吸收检测

使用空白溶液调节好紫外-吸收可见分光光度计的基线后，放入含有5%的dmso的5μm探针pbs溶液，再加入适量的硫化钠水溶液，使得硫化钠终浓度为200μm。测试不同时间的探针与硫化氢相互作用的紫外-吸收曲线。由图2可以看出，随着时间的延续，在370nm处的吸收峰(探针本身的吸收峰)逐渐降低，而在445nm处的吸收峰(探针与硫化氢相互作用后还原产物的吸收峰)逐渐升高。

实施例3

内质网硫化氢荧光探针na-er-h2s的选择性测试

溶液准备：制作相关待检测物的母液浓度：100mm，包括：各种常见阴阳离子、氨基酸、活性氧氮类物质；制作浓度为1mm探针的dmso溶液作为测试母液。

测试液制作：量取15μl探针母液、135μldmso，使用pbs缓冲定容到3ml，然后加入适量的待分析物(使得待分析物的浓度为：活性氧、活性氮100μm；离子和氨基酸2.5mm)，摇匀并用荧光光谱仪进行荧光检测(λex=445nm,λem=543nm)，并根据的道德荧光曲线制作荧光强度柱状图（见图3），有图3得知，该荧光探针专一性识别硫化氢。

实施例4

不同浓度的硫化钠(硫化氢释放试剂)对荧光探针na-er-h2s的荧光滴定实验

溶液准备：配制100mm硫化钠的pbs水溶液10ml作为硫化氢母液；配制1mm的该甲醛探针dmso溶液5ml作为探针母液。

配制探针浓度为5μmpbs缓冲溶液(含5%dmso)，分别加入不同浓度的甲醛溶液(0-500μm)作用完全，然后使用荧光光谱仪进行荧光测试(λex=445nm,λem=543nm)，建立荧光滴定谱图(见图4)，如图4所示，随着硫氢化钠浓度的增加，荧光强度逐渐增高。

实施例5

内质网硫化氢荧光探针na-er-h2s与硫化钠溶液作用的动力学检测

溶液准备：配制100mm硫化钠的pbs水溶液10ml作为硫化氢母液；配制1mm的该甲醛探针dmso溶液5ml作为探针母液。

配制探针浓度为5μmpbs缓冲溶液(含5%dmso)，分别加入不同浓度的硫化钠溶液(0-500μm)相互作用，随后进行该探针的动力学检测(λex=445nm,λem=543nm)，每5分钟测试一次，一共检测60min，待测试结束后，建立该探针的荧光强度与时间的动力学曲线(如图5)。可以看出，在硫氢化钠溶液浓度为500μm时，达到平衡的时间大约为30min。

实施例6

内质网硫化氢荧光探针na-er-h2s的外源性硫化氢细胞成像测试

将密度为3×10⁵个/ml的hela细胞接种到35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，分成三组实验组进行培养：(1)空白hela细胞组；(2)hela细胞外加5μm探针孵育30min；(3)hela细胞外加5μm探针孵育30min后再外加250μm硫化氢孵育30min；待培养结束后，用pbs缓冲液冲洗细胞2~3次，用尼康荧光共聚焦显微镜分别拍摄这三组条件下培养的hela细胞的荧光照片，发现第(3)组的hela细胞发出强烈荧光。(结果见图6)。

实施例7

内质网硫化氢荧光探针na-er-h2s的共定位细胞成像测试

将密度为3×10⁵个/ml的癌细胞接种到成像35mm培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，分成两组实验组进行培养：细胞与商品级内质网红色定位染料孵育15min后，然后加入与5μm探针孵育30min，再与加入250μm硫化钠孵育30min；待培养结束后，用pbs缓冲液冲洗细胞2~3次，用尼康荧光共聚焦显微镜分别拍摄培养的细胞的荧光照片，都可以发现该探针能够高度定位在细胞内质网上，并能够识别其中的硫化氢。其中，实验中共定位系数为0.90（结果见图7）。