一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用的制作方法

本发明涉及工业微生物、食品和饲料工业领域，具体涉及一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用。

背景技术：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)是一种人体所必需的多不饱和脂肪酸。在分子结构上，dha为含有22个碳原子和6个双键的直链脂肪酸，因其第1个双键出现在脂肪酸链甲基端的第3位碳原子上，故属于ω-3系列脂肪酸(omega-3)。dha具有重要的生理功能，例如促进神经系统发育、改善视网膜功能、提高视力、预防心血管疾病、治疗心血管疾病、抗炎症和抑制过敏反应等等。由于日常饮食中的dha往往含量不足，因此在食品或奶粉中添加dha对人类尤其是婴幼儿和老年人具有重要意义。

目前，生产dha的方法主要有两种：一种是传统dha来源，即从海洋鱼类(主要包括鲑鱼、鲭鱼、三文鱼和沙丁鱼)组织中提取，但通过提取所获得鱼油的质量会随着鱼的种类、季节和捕捞地的变化而受到影响，并且鱼油的质量还受到日益严重的鱼资源匮乏以及环境污染等影响；另一种是新兴的dha生产方法，即利用海洋微生物进行发酵生产dha，该方法具有周期短、不受客观条件影响、没有鱼腥味等优势，具有广泛的前景。用于发酵生产dha的海洋微生物主要为裂殖壶菌(schizochytrium)，但目前用于发酵生产dha的裂殖壶菌，由于自身总脂肪酸含量、dha含量、生长速率等技术指标受限，无法进一步提高产量、降低成本。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何生产二十二碳六烯酸。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株生产二十二碳六烯酸的细菌。

本发明所提供的生产二十二碳六烯酸的细菌为裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.13746。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂，该菌剂含有所述裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746。

所述裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746、或、所述菌剂在生产二十二碳六烯酸中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种生产二十二碳六烯酸的方法，该方法包括发酵培养所述裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746，得到二十二碳六烯酸的步骤。

上述方法中，所述发酵培养使用的发酵培养基溶质及其溶度可为：葡萄糖20～120g/l(如20～60g/l、60～120g/l、20g/l、60g/l或120g/l)、谷氨酸或谷氨酸钠5～15g/l(如5～10g/l、10～15g/l、5g/l、10g/l或15g/l)、玉米浆干粉3～15g/l(如3～10g/l、10～15g/l、3g/l、10g/l或15g/l)、naso45～24g/l(如5～14g/l、14～24g/l、5g/l、14g/l或24g/l)、kcl0.1～1.0g/l(如0.1～0.5g/l、0.5～1.0g/l、0.1g/l、0.5g/l或1.0g/l)、mgso41.0～3.0g/l(如1.0～2.0g/l、2.0～3.0g/l、1.0g/l、2.0g/l或3.0g/l)、k2so40.3～1.5g/l(如0.3～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.3g/l、1.0g/l或1.5g/l)、kh2po40.5～1.5g/l(如0.5～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.5g/l、1.0g/l或1.5g/l)、(nh4)2so40.5～1.5g/l(如0.5～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.5g/l、1.0g/l或1.5g/l)、cacl20.1～1.0g/l(如0.1～0.5g/l、0.5～1.0g/l、0.1g/l、0.5g/l或1.0g/l)；溶质可为水；ph值可为5.0～6.5(如5.0、6.0或6.5)。所述发酵培养基具体可为：将葡萄糖60g、谷氨酸或谷氨酸钠10g、玉米浆干粉10g、naso414g、kcl0.5g、mgso42.0g、k2so41.0g、kh2po41.0g、(nh4)2so41.0g和cacl20.5g溶于1l蒸馏水，调节ph值至6.0。

上述方法中，所述发酵培养中初始生物量可为1.0×10⁸～2.5×10⁸cfu/ml(如1.0×10⁸～1.5×10⁸cfu/ml、1.5×10⁸～2.5×10⁸cfu/ml、1.0×10⁸cfu/ml、1.5×10⁸cfu/ml或2.5×10⁸cfu/ml)。

上述方法中，所述发酵培养中初始生物量可为5.0×10⁸～3.0×10⁹cfu/ml(如5.0×10⁸～1.0×10⁹cfu/ml、1.0×10⁹～3.0×10⁹cfu/ml、5.0×10⁸cfu/ml、1.0×10⁹cfu/ml或3.0×10⁹cfu/ml)。

上述方法中，所述发酵培养接种量可为3～10％(如3～5％、5～10％、3％、5％或10％)。

上述方法中，所述发酵培养的培养条件可为22～28℃(如22～25℃、25～28℃、22℃、25℃或28℃)培养72～120h(如72～100h、100～120h、72h、100h或120h)，溶氧浓度为5～80％(如5～50％、50～80％、5％、50％或80％)。

上述方法中，所述“发酵培养所述裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746”还可包括制备一级种子液和/或制备二级种子液和/或制备发酵一级种子液和/或制备发酵二级种子液；

制备一级种子液的步骤可如下：摇瓶培养所述裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746，得到一级种子液；

制备二级种子液的步骤可如下：摇瓶培养一级种子液，得到二级种子液；

制备发酵一级种子液的步骤可如下：发酵培养二级种子液，得到发酵一级种子液；

制备发酵二级种子液的步骤可如下：发酵培养发酵一级种子液，得到发酵二级种子液。

所述制备一级种子液和所述制备二级种子液中，所述摇瓶培养使用的摇瓶培养基溶质及其溶度可为：葡萄糖10～90g/l(如10～50g/l、50～90g/l、10g/l、50g/l或90g/l)、酵母粉5～25g/l(如5～15g/l、15～25g/l、5g/l、15g/l或25g/l)；溶质可为水；ph自然。所述“摇瓶培养”的培养条件为22～28℃(如22～25℃、25～28℃、22℃、25℃或28℃)、150～250rpm/min(如150～200rpm/min、200～250rpm/min、150rpm/min、200rpm/min或250rpm/min)培养24～48h(如24～36h、36～48h、24h、36h或48h)。所述摇瓶培养的接种量为3～10％(如3～5％、5～10％、3％、5％或10％)。所述摇瓶培养基具体可为：将葡萄糖50g和酵母粉15g溶于1l蒸馏水，ph值自然。

所述制备发酵一级种子液和所述制备发酵二级种子液中，所述发酵培养使用的种子培养基溶质及其溶度可为：葡萄糖20～100g/l(如20～60g/l、60～120g/l、20g/l、60g/l或120g/l)、酵母粉5～15g/l(如5～10g/l、10～15g/l、5g/l、10g/l或15g/l)、naso45～24g/l(如5～10g/l、10～24g/l、5g/l、10g/l或24g/l)、kcl0.1～1.0g/l(如0.1～0.5g/l、0.5～1.0g/l、0.1g/l、0.5g/l或1.0g/l)、mgso41.0～3.0g/l(如1.0～2.0g/l、2.0～3.0g/l、1.0g/l、2.0g/l或3.0g/l)、k2so40.3～1.5g/l(如0.3～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.3g/l、1.0g/l或1.5g/l)、kh2po40.5～1.5g/l(如0.5～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.5g/l、1.0g/l或1.5g/l)、(nh4)2so40.5～1.5g/l(如0.5～1.0g/l、1.0～1.5g/l、0.5g/l、1.0g/l或1.5g/l)、cacl20.1～1.0g/l(如0.1～0.5g/l、0.5～1.0g/l、0.1g/l、0.5g/l或1.0g/l)；溶质可为水；ph值可为5.0～6.5(如5.0、6.0或6.5)。所述“发酵培养”的培养条件为22～28℃(如22～25℃、25～28℃、22℃、25℃或28℃)培养24～48h(如24～36h、36～48h、24h、36h或48h)，溶氧浓度为10～80％(如10～50％、50～80％、10％、50％或80％)。所述发酵培养的接种量为3～10％(如3～5％、5～10％、3％、5％或10％)。所述种子培养基具体可为：将葡萄糖60g、酵母粉10g、naso410g、kcl0.5g、mgso42.0g、k2so41.0g、kh2po41.0g、(nh4)2so41.0g和cacl20.5g溶于1l蒸馏水，调节ph值至6.0。

发酵培养裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01，得到发酵液。结果表明，该发酵液中dha占油脂的含量为45.0％～60.0％。因此，利用本发明提供的裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01可以生产dha，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为裂殖壶菌hs01的菌落形态特征。

图2为裂殖壶菌hs01的菌体形态特征。

保藏说明

菌种名称：裂殖壶菌

拉丁名：schizoochytriumlimacinum

菌株编号：hs01

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：cgmcc

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2017年3月10日

保藏中心登记入册编号：cgmccno.13746

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的培养基如下：

麦芽汁琼脂培养基：将150g麦芽浸粉溶于1l混合液(由1体积份天然海水和1体积蒸馏水混合而成)，ph值自然；然后加入琼脂粉至其浓度为15g/100ml，得到的培养基。

筛选液体培养基：将葡萄糖50g和酵母粉15g溶于1l混合液(由1体积份天然海水和1体积蒸馏水混合而成)，ph值自然。

筛选固体培养基：向筛选液体培养基中加入琼脂粉至其浓度为15g/100ml，得到的培养基。

筛选平板：将约55℃的筛选固体培养基倒入培养皿，冷却后得到的固体平板。

摇瓶培养基：将葡萄糖50g和酵母粉15g溶于1l蒸馏水，ph值自然。

种子培养基：葡萄糖60g、酵母粉10g、naso410g、kcl0.5g、mgso42.0g、k2so41.0g、kh2po41.0g、(nh4)2so41.0g和cacl20.5g溶于1l蒸馏水，调节ph值至6.0。

发酵培养基：将葡萄糖60g、谷氨酸或谷氨酸钠10g、玉米浆干粉10g、naso414g、kcl0.5g、mgso42.0g、k2so41.0g、kh2po41.0g、(nh4)2so41.0g和cacl20.5g溶于1l蒸馏水，调节ph值至6.0。

玉米浆干粉为北京索莱宝科技有限公司的产品，产品目录号为fa0010。

酵母粉为安琪酵母股份有限公司的产品，产品目录号为lmo2。

实施例1、裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746的分离、鉴定和保藏

一、裂殖壶菌hs01的分离

1、本申请的发明人从福建省漳州市云霄县红树林多处采集裂殖壶菌，混合，得到混合液；将0.5ml混合液接种至5ml筛选液体培养基，然后25℃、200rpm/min培养2d，得到培养菌液。

2、将步骤1得到的培养菌液均匀涂布于筛选平板上，25℃静置培养2d，产生单菌落。

3、完成步骤2后，分别挑取单菌落接种至5ml发酵培养基，然后25℃、200rpm/min培养2d，得到培养菌液。

4、取步骤3得到的培养菌液，4℃、2000rpm离心5min，收集菌体。

5、取菌体1.0～2.0g至具塞量筒(规格为100ml)中，先加入15ml浓度为8.3mol/l的hcl水溶液，盖好盖子，置于70～80℃水浴中水解50～60min(期间每10min置于漩涡混合器上振荡具塞量筒1次)；待冷却到室温后，先加入10ml95％(v/v)乙醇水溶液，充分振摇均匀后，再加入20ml无水乙醚充分振摇萃取1～2min，最后加入20ml石油醚，充分振摇萃取1～2min，静置分层，将上层有机相置于玻璃称量皿(已烘干称过空重)，将该玻璃称量皿置于通风橱中的沸水浴上使有机相充分蒸发干净(务必充分挥发干净)，液相即为油脂。

6、取步骤5提取的油脂，按照gb26400-2011食品安全国家标准检测dha含量，按照aoac996.06的方法检测脂肪酸的组成及含量。

挑选dha含量较高的菌株，反复纯化24次。将筛选到的一株裂殖壶菌菌株命名为裂殖壶菌hs01。

将裂殖壶菌hs01单克隆接种至发酵培养基连续传代12代并按照上述步骤检测dha含量。结果表明，裂殖壶菌hs01生产dha的稳定性良好。

二、裂殖壶菌hs01的鉴定

1、形态学鉴定

将裂殖壶菌hs01接种至麦芽汁琼脂培养基上，25℃暗培养，5d后观察菌落的形态并通过高分辨率透射电镜分析观察菌体的形态特征。

实验结果见图1和图2。结果表明，裂殖壶菌hs01的菌落直径为2～4.3mm，白色(后期浅橙色)，边缘不整齐；菌体以裂殖方式进行增殖，细胞壁薄，球形，无色或浅橙色，透明，大小为4.5～15.5μm，游动孢子及外质网未见。

2、18srdna序列同源性分析

裂殖壶菌hs01的18srdna的部分序列如序列表中的序列1所示。

裂殖壶菌hs01的18srdna的部分序列如序列表中的序列2所示。

综合上述各个鉴定结果，裂殖壶菌hs01为裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)。

三、裂殖壶菌hs01的保藏

裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01已于2017年03月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.13746。裂殖壶菌hs01的全称为裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01cgmccno.13746，简称为裂殖壶菌hs01。

实施例2、裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01发酵生产dha

一、裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01发酵生产dha

1、将裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01单克隆接种至装有2ml摇瓶培养基的摇瓶(规格为10ml)中，22～28℃、150～250rpm/min培养24～48h，得到一级种子液。

2、取一级种子液，以3～10％(v/v)的接种量接种至装有250ml摇瓶培养基的摇瓶(摇瓶规格为1l)中，22～28℃、150～250rpm/min培养24～48h，得到二级种子液。

3、取二级种子液，以3～10％(v/v)的接种量接种至装有3l种子培养基的发酵罐(发酵罐规格为5l)中，22～28℃培养24～48h(溶解氧为10～80％)，得到发酵一级种子液。

4、取发酵一级种子液，以3～10％(v/v)的接种量接种至装有50l发酵培养基的发酵罐(发酵罐规格为100l；接种后初始生物量为1.0×10⁸～2.5×10⁸cfu/ml)中，22～28℃培养72～120h(溶解氧为5～80％)，得到发酵液。发酵液中即含有dha。

二、发酵液中的脂肪酸成分的分析

按照实施例1步骤一中5的方法，提取发酵液的油脂，然后按照gb26400-2011食品安全国家标准检测dha含量，按照aoac996.06的方法检测脂肪酸的组成及含量。

实验结果见表1。结果表明，dha占油脂的含量为45.0％～60.0％。

表1

三、发酵液中dha的分离和质量鉴定

1、取步骤一得到的发酵液，依次进行裂殖壶菌的细胞破壁和dha藻油粗油的提取(进行裂殖壶菌的细胞破壁和dha藻油粗油的提取的方法记载于中国发明专利文献cn101817738b)。

2、对步骤1提取的dha藻油粗油进行精炼(精炼的方法记载于中国发明专利文献cn103865642b)。

dha藻油粗油经过精炼后的质量指标见表2。

表2

实施例3、裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01大规模发酵生产dha

1、将裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01单菌落接种至装有20ml摇瓶培养基的摇瓶(摇瓶规格为250ml)中，22～28℃、150～250rpm/min培养24～48h，得到一级种子液。

2、取一级种子液，以3～10％(v/v)的接种量接种至装有250ml摇瓶培养基的摇瓶(摇瓶规格为2l)中，22～28℃、150～250rpm/min培养24～48h，得到二级种子液。

3、取二级种子液，以3～10％(v/v)的接种量接种至装有500l种子培养基的发酵罐(发酵罐规格为1000l)中，22～28℃培养24～48h(溶解氧为10～80％)，得到生物量在15～30g/l的发酵一级种子液。

4、取发酵一级种子液，以5～15％(v/v)的接种量接种至装有5000l种子培养基的发酵罐(发酵罐规格为8000～10000l)中，22～28℃培养24～48h(溶解氧为10～80％)，得到生物量在15～30g/l的发酵二级种子液。

5、取发酵二级种子液，以5～15％(v/v)的接种量接种至装有30000l发酵培养基的发酵罐(发酵罐规格为75000l；接种后初始生物量为5.0×10⁸～3.0×10⁹cfu/ml)中，22～28℃培养72～120h(溶解氧为5～80％)，得到发酵液。发酵液中即含有dha。

按照实施例2中步骤二的方法，分析发酵液中的脂肪酸成分。结果表明，该发酵液中dha占油脂的含量为35.0～60.0％。

因此，利用本发明提供的裂殖壶菌(schizoochytriumlimacinum)hs01生产dha具有较高的生产价值。

<110>厦门汇盛生物有限公司

<120>一株生产二十二碳六烯酸的细菌及其应用

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