本发明总体涉及环境监测技术，具体涉及一种水体微生物污染来源定量解析方法。
背景技术：
：未经处理(或未完全处理)人和畜禽粪便污染是造成水体微生物污染的最主要原因，如何快速准确区分水体中微生物污染的主要来源并及时有效的进行针对性源头控制是解决问题的关键环节。目前我国基本符合标准的饮用水水源仅占30％左右，且类型以生物污染为主(69.1％)，远高于化学污染的比例。世界各国通常将粪大肠菌群或大肠埃希氏菌作为指示微生物，以反映水体微生物污染状况，但这些传统指标仅能反映出粪便污染的程度，不能识别污染的确切来源，更不能评价不同污染源的各自贡献率。由于缺乏粪便污染来源的准确信息使得目前治理仍停留在见污治污阶段，极大增加了污染治理的难度与成本。近年来，欧美等发达国家纷纷开展了以宿主特异性生物标记为基础的水体微生物污染源解析的研究工作，并已开发出了猪、牛、人、鸡、野禽等动物的多种特异性引物，及时提供粪便污染来源的准确信息以及时有效的进行针对性源头控制。然而，宿主消化道内各种肠道菌群之间的相互作用极为复杂，并且外界环境的差异性易导致消化道内菌群的基因发生变化，造成不同地区特异性基因表达差异的现象较为普遍，同一引物在不同地区的特异性可能存在很大差异，且环境的演变过程无法通过单个基因完全表现出来，因此应积极开展地域适应性的生物标记研究。迄今为止，在我国尚未见到利用荧光定量pcr技术(qpcr)对水体中人、牛、猪及鸡等动物的粪便污染进行定量识别的研究，也没有相关的专利技术。技术实现要素：本发明的目的是提供一种水体微生物污染来源定量解析方法，该方法可识别低浓度的目标微生物，数据可靠。本发明基于拟杆菌宿主特异性生物标记引物溯源法，采用qpcr技术定量分析环境水体中微生物污染物的主要宿主来源，包括如下步骤：(1)引物区域性验证：在区域目标水域周边采集不同生物的粪便样品，样品采集后保存于冰盒中，6h内送回实验室进行后续处理；采用粪便基因组dna提取试剂盒通过悬浮、破碎、吸附柱纯化等步骤从粪便样品中提取基因组dna，置于-20℃冰箱储存；以各生物粪便中提取的基因组dna为模板，选取已有的各生物拟杆菌特异性引物分别进行qpcr扩增，分析引物的灵敏度与特异性；选取灵敏度和特异性都在85％以上的引物作为区域特异性引物；(2)标准曲线制作：以区域特异性引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，对扩增后的目标产物进行纯化回收，连接到pmd19-tvector载体上，转化dh5α感受态细胞，采用含有氨苄抗生素的平板培养基挑取阳性克隆，提取质粒dna，测定其浓度；将质粒10倍梯度稀释，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77个梯度，并以此为模板，每个梯度作为标准品设3个重复，进行qpcr扩增；反应结束之后，进行标准曲线的制作；(3)污染源解析：从区域目标水域进行水样品采集，所有样品采集后进行编号并保存于冰盒中，在实验室中提取水样品中的基因组dna；采用区域特异性引物进行qpcr扩增，结果代入标准曲线方程进行计算，得出目标水域中各微生物的浓度值，根据各微生物的浓度值来解析区域目标水域的污染源。优选情况下，所述qpcr扩增条件：扩增体系为20ul：premixextaqtmii(2×)10ul；ddh2o，6.4ul；上下游引物各0.8ul；dna模板2ul；扩增程序：①预变性，95℃，30s；②变性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min；40个循环。具体情况下，步骤(1)中引物的灵敏度与特异性判定依据为：将cq＝32.0所对应的拷贝数作为最低定量限来验证引物的特性，当引物扩增的cq<32.0且熔解曲线呈现单一的熔解峰时判定为阳性结果，而cq≥32.0时判定为阴性结果。具体情况下，步骤(2)中标准曲线的判定依据为：标准曲线的相关系数(r2)大于0.99，结果可信；扩增效率(e)是通过标准曲线斜率来确定的，两者符合公式e＝10(-1/slope)-1；如果一个反应的标准曲线斜率为-3.32，则该反应的扩增效率e＝100％，扩增效率(e)在90％～110％之间是可接受的。本发明通过选取针对目标区域具有特异性强、灵敏度高且可定量分析的特异性生物标记引物，解决特异性生物标记引物的地区性差异，通过qpcr扩增技术来解析环境水体的微生物污染定量源，可识别低浓度的目标微生物，适用于不同水质的环境水体，为环境水体的监测、溯源和治理提供了可靠的依据。附图说明图1为各采样点指示微生物浓度。具体实施方式为充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出具体实施例。一、试剂和方法具体实施例中，粪便基因组dna提取试剂盒采用天根生化科技(北京)有限公司生产的dp328-02，水体基因组dna提取试剂盒采用magen生物科技有限公司d3145-02，质粒提取试剂盒采用天根生化科技(北京)有限公司生产的dp105-03，dna纯化试剂盒采用天根生化科技(北京)有限公司生产的dp214-03。各提取和纯化方法均可参见各试剂盒的说明书进行。其它试剂均可通过现有商业渠道获得。常规pcr步骤：扩增体系为20μl：2×pcrdsmix10μl；ddh2o，7.6μl；上、下游引物各0.8μl；dna模板0.4μl。扩增体系为：①预变性，95℃，5min；②变性，95℃，30s；③退火，60℃，30s；④延伸，72℃，30s，35个循环；⑤终延伸，72℃，5min。对扩增产物进行纯化。qpcr步骤：扩增体系为20ul：premixextaqtmii(2×)10ul；ddh2o，6.4ul；上下游引物各0.8ul；dna模板2ul；qpcr扩增程序：①预变性，95℃，30s；②变性，95℃，5s；③退火延伸，60℃，1min；40个循环。二、引物区域性验证2.1样品采集在珠江三角洲地区东江和北江流域的多个畜禽养殖场内采集不同生物的粪便样品，在广州市医院采集人粪样品。粪便样品数共计140份，其中人31份，鸡20份，猪32份，狗14份，兔8份，牛28份，马7份。样品采集后保存于冰盒中，6h内送回实验室进行后续处理。采用粪便基因组dna提取试剂盒通过悬浮、破碎、吸附柱纯化等步骤从粪便样品中提取基因组dna，具体步骤按照说明书进行，置于-20℃冰箱储存。2.2特征生物标记引物选取选用已报道的人源、反刍动物、猪源和鸡源拟杆菌特征生物标记引物进行验证试验，具体引物如表1所示。表1特征生物标记引物引物的验证通常采用常规pcr技术进行，而本方法采用qpcr技术进行验证和分析。qpcr技术以到达阈值的循环次数(cq值)和熔解曲线为基础进行有效分析。当各引物的cq值大于32.0时，会出现复孔之间cq值误差较大，甚至未能得到扩增结果等现象。因此，在目标研究区域中，各引物可将cq＝32.0所对应的拷贝数作为最低定量限来验证引物的特性，当引物扩增的cq<32.0且熔解曲线呈现单一的熔解峰时判定为阳性结果，而cq≥32.0时判定为阴性结果。依据此标准，选取了鸡源特异性引物11#(qc160f-hu/qbac265r-hu)分别进行普通pcr及qpcr扩增实验，以观察不同方法对引物灵敏度与特异性表达的差异。结果如表2所示。表2pcr及qpcr方法对鸡源特异性引物的验证结果采用11#引物在20个鸡粪样本中通过pcr及qpcr方法得到的阳性样本数分别为15个和17个，普通pcr验证的灵敏度及特异性均小于80％，而qpcr验证的灵敏度及特异性分别为85％和90.2％，适用于目标研究区域。说明qpcr方法较普通pcr而言，具有更高的检出率，对不同引物的特异性扩增也更强，在引物验证阶段及后续的实际应用中，具有明显的优势。2.3引物的区域适用性验证以各动物粪便中提取的dna为模板，选取已有的人、反刍动物、猪及鸡源拟杆菌特异性引物进行qpcr扩增。各引物扩增的统计结果及灵敏度和特异性分析见表2和表3。表2拟杆菌特异性引物的扩增结果表3拟杆菌特异性引物灵敏度与特异性分析采用人源特异性引物(1#～4#)分别对各粪便样品进行qpcr扩增时，1#～4#引物特异性较强，但灵敏度除1#达到100％以外，其它均较差。反刍动物引物(5#-8#)中，5#的灵敏度及特异性分别为92.9％和99.1％，效果较好。6#、7#引物特异性(均为88.2％)较强，但灵敏度(分别为78.6％和46.4％)较差。8#引物的特异性较强(97.4％)，而灵敏度仅为25％。对猪源拟杆菌特异性引物(9#、10#)验证时，9#引物的灵敏度及特异性为93.8％和96.4％，该引物的灵敏度较10#引物高出71.9％。鸡源特异性引物11#具有较好的灵敏度(85％)及较强的特异性(92.3％)，分别比12#引物高出25％和11.2％。综合以上结果，人源特异性引物1#(qhs601f/qbac725r)、反刍动物特异性引物5#(bacb2-590f/bac708rm)、猪源特异性引物9#(bac41f/bac163r)及鸡源特异性引物11#(qc160f-hu/qbac265r-hu)具有较高的灵敏度和较强的特异性，适用于珠三角区域。三、标准曲线的制作选取已筛选出的人源特异性引物1#(qhs601f/qbac725r)、反刍动物特异性引物5#(bacb2-590f/bac708rm)、猪源特异性引物9#(bac41f/bac163r)及鸡源特异性引物11#(qc160f-hu/qbac265r-hu)引物对提取的基因组dna进行pcr扩增，对扩增后的目标产物进行纯化回收，连接到pmd19-tvector载体上，转化dh5α感受态细胞，采用含有氨苄抗生素的平板培养基挑取阳性克隆，提取质粒dna，测定其浓度。将质粒10倍梯度稀释，稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-77个梯度，并以此为模板，每个梯度作为标准品设3个重复，进行qpcr扩增。反应结束之后，进行标准曲线的制作，根据标准曲线拟合公式，具体结果如表4。表4四种引物的标准曲线公式标准曲线的相关系数(r2)大于0.99，结果可信。扩增效率是(e)是通过标准曲线斜率来确定的，两者符合公式e＝10(-1/slope)-1。如果一个反应的标准曲线斜率为-3.32，则该反应的扩增效率e＝100％。一般认为扩增效率(e)在90％～110％之间是可接受的。质粒相较于常规pcr产物更纯、更稳定，定量准确，可以减少模板误差，同时可以获得更高的扩增效率。常规pcr产物不纯是指pcr产物不单一，会影响后续的梯度稀释及定量的准确性。四、实际污染源解析对广州市8处(g1～g8)、珠海市6处(z1～z6)地表水进行样品采集，每个采样点均在河道横截面左、中、右处各采集一份水样，共计42份水样。所有样品采集后进行编号并保存于冰盒中，于6h内运抵实验室进行后续实验。各采样点如表5所示。表5各采样点分布表所在市采样点简称广州增江口g1广州大敦g2广州沙湾g3广州东塱g4广州良口镇g5广州温泉镇g6广州流溪河山庄g7广州人和镇g8珠海香洲湾z1珠海吉林大学排污口z2珠海石角明z3珠海木乃滩z4珠海鸡啼门z5珠海鸡啼口出海口z6量取每份水样100ml采用0.22μm的滤膜通过真空过滤器过滤，使菌体留在滤膜上，并按照水体dna提取试剂盒说明书提取留在滤膜上的菌体dna。采用人源特异性引物1＃(qhs601f/qbac725r)、反刍动物特异性引物5＃(bacb2-590f/bac708rm)、猪源特异性引物9＃(bac41f/bac163r)及鸡源特异性引物11＃(qc160f-hu/qbac265r-hu)进行qpcr扩增，结果代入标准曲线方程式进行计算，得出目标水域中各微生物的浓度值，测试结果如图1所示。拟杆菌专性厌氧的特性也会使其在水体中快速衰减，因此拟杆菌作为指示菌通常用于评估近期污染。但在城市水体中，由于人粪可能来自于未经处理的生活污水、市政管道的污水溢流或污水处理厂等多种途径，使得人源特异性拟杆菌可以维持在较高浓度水平。从图1可以观察到，qhb浓度较qrb平均高出1～2个数量级，较qcb高出2～4个数量级，说明各水体主要受到人粪污染较为严重，这也与城市水体主要接纳生活污水及市政污水的实际情况相符。而各采样点检测到的qrb、qcb也表明水体同时受到反刍动物、禽类粪便的污染。但在实际采样过程中发现，除g5、g6及z4、z5、z6附近有部分养殖场及耕地外，其余采样点所在河流两旁主要为商业区、居民区，这说明水体中的qrb、qcb可能为上游污染源迁移而来，与实地污染特征相符。本发明通过选取识别出在珠三角地区具有特异性强、灵敏度高且可定量分析的人源、牛源、猪源和鸡源特异性生物标记引物，解决特异性生物标记引物的地区性差异，通过qpcr扩增技术来解析环境水体的微生物污染定量源，可识别低浓度的目标微生物，适用于不同水质的环境水体。当前第1页12