一种防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株及其应用。
背景技术：
：猕猴桃溃疡病是一种毁灭性细菌病害。该病主要危害猕猴桃的主干、枝蔓、新梢和叶片，极易造成植株死亡。该病1980年在日本首次发现，1983年后在美国等陆续发现。1987年病原菌被鉴定为丁香假单孢杆菌猕猴桃致病性变种pseudomonassyringaepv.actinidiae。1984年以前，我国没有猕猴桃细菌性溃疡病分布，1985年最早发现于湖南东山峰农场，并在短短的10年时间里，迅速扩散蔓延到我国多数猕猴桃栽培区域。该病来势凶猛，常常大规模暴发，导致大面积毁园，造成严重的经济损失，直接威胁猕猴桃产业的发展。1996年猕猴桃细菌性溃疡病菌被列入我国森林植物检疫对象名单。2013年被列为“全国林业危险性有害生物名单”(国家林业局2013年第4号公告)。目前国内外尚无根治此病的有效技术，植株一旦染病便迅速传播漫延开来，势不可挡。轻病果园死亡株率一般5～10％，重病园死亡株率高达20～60％。果农束手无策，或让其自然死亡，或人工挖除，大多弃园改种其他品种的果树。目前对于猕猴桃细菌性溃疡病的防治主要是采用以链霉素和铜制剂为主的药剂防治,防治效果不甚理想。然而大量使用铜制剂和已经引起了溃疡病菌的抗药性问题，同时抗生素的大量使用所带来的食品安全问题已经严重影响着溃疡病的田间防治效果。因而寻找开发新型高效的生物农药将对猕猴桃产业的稳定和发展带来福音。技术实现要素：本发明提供一种毒害低、防治猕猴桃溃疡病效果优异的新的假单胞菌菌株，旨在寻找生物农药新来源，开发一种可以用于猕猴桃溃疡病防治的新型生物杀菌剂。本发明防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株，所述假单胞菌(pseudomonassp.)名称为假单胞菌spanrs-62，菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏编号为cctccno：m2016556(简称为假单胞菌cctccm2016556)，保藏单位的地址位于中国武汉大学，保藏日期为2016年10月11日。本发明假单胞菌cctccm2016556菌株呈乳白色，胶质状，表面光滑湿润，中心凸起，边缘整齐，粘度正常。本发明的假单胞菌cctccm2016556是在江西省井冈山海拔为1414m的野生猕猴桃植株分离得到的，其分离筛选方法为：1、将采集的猕猴桃枝条用清水冲洗干净，75％的酒精表面消毒，室温风干，用消毒后的刀片切取供试样本适量，装进研磨袋中，加入适量生理盐水，研磨、浸泡3min，取其植物研磨液的上清液100μl加入新配制的kb培养基中，用接种环进行涂布、划线处理。2、将接样培养皿于室温下培养一定时间后，待皿中长出菌落，挑取边缘清晰的菌落，于新配制的kb培养基平板上反复划线纯化，可得到spanrs-62单菌落，然后转移到冻存管中，用甘油封存，放置于-80℃超低温冰箱中保存菌种，用于进行溃疡病的拮抗实验。本发明还提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含上述防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株，必要时，还包含菌剂制备中常用的载体和辅料。本发明还提供上述假单胞菌菌株在防治猕猴桃溃疡病中的应用。进一步的，上述假单胞菌菌株在防治猕猴桃溃疡病中的应用，其中所述猕猴桃溃疡病的致病菌为猕猴桃细菌性溃疡病病原菌(pseudomonassyringaepv.actinidiae)。本发明还提供一种假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液。本发明还提供一种假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液在防治猕猴桃溃疡病中的应用。进一步的，上述假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液在防治猕猴桃溃疡病中的应用，其包括将上述假单胞菌菌株采用kb固体培养基进行培养，得到培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液；用所得到的假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液抑制猕猴桃溃疡病的致病菌的生长。进一步的，上述假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液在防治猕猴桃溃疡病中的应用，所述猕猴桃溃疡病的致病菌为猕猴桃细菌性溃疡病病原菌(pseudomonassyringaepv.actinidiae)。上述假单胞菌菌株的培养物、发酵培养液、发酵培养液的过滤液在防治猕猴桃溃疡病中的应用，所述kb固体培养基组成成分为：以1lkb固体培养基为基准计，含有新蛋白胨10.0g，丙三醇7.5g，mgso4·7h2o1.5g，k2hpo41.0g，琼脂16.0g，h2o1.0l。本发明假单胞菌cctccm2016556从采集的猕猴桃枝条分离纯化得到的，分离筛选方法简单，该菌株对猕猴桃细菌性溃疡病病原菌有很强的抑制作用，能够明显抑制猕猴桃细菌性溃疡病病原菌菌丝的生长。该菌株分离自健康植物组织内，因而产生的活性代谢产物对植物组织没有明显毒害作用，且性质稳定，喷湿方便，防治猕猴桃溃疡效果显著，为猕猴桃溃疡的防治提供了一条环保、简单、有效的途径，利用环境保护。附图说明图1为本发明假单胞菌cctccm2016556菌株形态图；图2为本发明假单胞菌cctccm2016556的菌株扫描电镜图；图3为本发明拮抗菌的室内防效实验中阴性对照组试验结果；图4为本发明拮抗菌的室内防效实验中阳性对照组试验结果；图5为本发明拮抗菌的室内防效实验中实验组试验结果。具体实施方式下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。实施例1假单胞菌cctccm2016556的分离与筛选本发明假单胞菌cctccm2016556菌源来自江西井冈山的野生猕猴桃枝条，采样点的海拔为1414m，经纬度为n26°36′30，e114°07′33；分离方为：1、将采集的猕猴桃枝条用清水冲洗干净，75％的酒精表面消毒，室温风干，用消毒后的刀片切取供试样本适量，装进研磨袋中，加入适量生理盐水，研磨、浸泡3min，取其植物研磨液的上清液100μl加入新配制的kb培养基中，用接种环进行涂布、划线处理。纯化的方法为：将接样培养皿于室温下培养一定时间后，待皿中长出菌落，挑取边缘清晰的菌落，于新配制的kb固体培养基平板上反复纯化3代，直到获得纯化的单菌落，将已纯化的菌株进行编号，然后转移到冻存管中，用甘油封存，放置于-80℃超低温冰箱中保存菌种。实施例2假单胞菌cctccm2016556的鉴定1.培养状态观察将保存菌种在kb固体培养基上活化，室温下培养，观察菌落生长情况，记录菌落的菌群特征，包括颜色、生长速度、形状、质地等。最终发现：本发明假单胞菌cctccm2016556菌株呈乳白色，胶质状，表面光滑湿润，中心凸起，边缘整齐，粘度正常；其菌种形态见图1所示；其扫描电镜图如图2所示。2.分子生物学鉴定dna提取：用细菌pcr通用引物27f(引物序列为：eubac27f[106]5'-agagtttgatcmtggctcag-3')和1492r(引物序列为：eubac1492r[106]5'-tacggytaccttgttacgact-3')将菌株进行16srdna扩增，得到的扩增片段长度约为250bp，再进行16srdna的序列测定，分子鉴定结果见序列表所示；测得的序列在genbank进行同源性搜索，与数据库内序列进行相似性分析，发现16srdna的序列测定结果就为假单胞菌。实施例3猕猴桃溃疡病拮抗菌的筛选3.1试验材料湖南省东山峰、江西省井冈山和四川省采集的猕猴桃样品所分离出的猕猴桃内生菌。供试猕猴桃溃疡病病原菌：经四川省自然资源科学研究分离鉴定的猕猴桃细菌性溃疡病病原菌pseudomonassyringaepv.actinidiae，具体如表1所示：表1供试病原菌编号供试溃疡病(pseudomonassyringaepv.actinidiae.psa)菌株pcpsa2012djyp1psa2013djyp6psa2013pj155psa2014eb185psa2014yj206psa2014ql猕猴桃溃疡病内生拮抗菌筛选：本实验运用牛津杯法进行猕猴桃溃疡病内生拮抗菌的筛选，具体步骤如下：1.将猕猴桃拮抗菌种子液按10％比例(v:v)混合lb培养液，28℃，150r/min，放入置于恒温摇床，震荡三天；2.用移液枪吸取100微升溃疡病病原菌菌液，用涂布棒平涂于kb培养皿上，做好标记；3.再在涂布病原的培养基上，放置牛津杯；每个培养皿放置三个牛津杯，并做三组重复；4.再用移液枪吸取200微升内生菌液，加入牛津杯中；于室温下培养5.2d后，观测平板中有无抑菌圈，以及抑菌圈的直径；5、将拮抗菌对供试溃疡病菌株的抑制活性分为较强(抑菌圈直径＞20mm)、中等(10.1～20mm)和较弱(0.1～10mm)3个等级，分别表示为较强(+++)、中等(++)、较弱(+)。本发明所用kb固体培养基组成成分为：以1lkb固体培养基为基准计，含有新蛋白胨10.0g，丙三醇7.5g，mgso4·7h2o1.5g，k2hpo41.0g，琼脂16.0g，h2o1.0l。lb液体培养基组成成分为：以1llb液体培养基为基准计，含有新蛋白胨10.0g，丙三醇7.5g，mgso4·7h2o1.5g，k2hpo41.0g，h2o1.0l。抑菌结果如下表2所示：表2拮抗菌对不同供试溃疡病菌株的抑制效果3.2拮抗菌的内防效实验及安全性实验3.2.1、选取红阳猕猴桃的新鲜枝条作为植物材料进行室内防效试验将病原菌和初步筛选出的拮抗菌接至新鲜的kb固体培养基平板，室温下培养24小时。用无菌生理盐水稀释制成含107cfu/ml的悬浮液。剪取一年生红阳猕猴桃枝条，每枝切成10cm小节，每枝条剪6小节(其中1小节接生理盐水作为对照)，次氯酸钠表面消毒后放入铺有滤纸的食品盒中保湿备用；用无菌锉刀在各小节两端造2个轻微伤口，蜡液封闭两段。同一枝条，将溃疡病菌株155(psa2014eb)接到6个小节的伤口中，剩余1小节接生理盐水作为对照；1天后随机选取5小节伤口处接拮抗菌假单胞菌spanrs-62。设置6组重复试验，于20℃下放置3周后，用灭菌刀片轻轻划开伤口处的表皮，观察溃疡病斑以及菌脓溢出情况，以评价拮抗菌的生防效果。试验结果如下：阴性对照组(实验结果如图3所示)，切伤口里面干燥，无溃疡病菌脓溢出(图中a处)；切伤口外面无溃疡病病斑，未变色，无菌脓溢出(图中b处)；阳性对照组(实验结果如图4所示)，切伤口里面有菌脓溢出(图中a处)；切伤口外面有溃疡病病斑，变色，有菌脓溢出(图中b处)；实验组(实验结果如图5所示)，切伤口里面干燥，无菌脓溢出(图中a处)；切伤口外面无病斑，未变色，无菌脓溢出(图中b处)。3.2.2、选取红阳猕猴桃植株作为植物材料进行田间防效试验在猕猴桃溃疡病发病的果园选取健康植株，冬剪修枝以后，将初步筛选出的拮抗菌活化在装有三角瓶的lb液体培养基中，放入置于恒温摇床，震荡三天；设置实验组和对照组，其中实验组用无菌生理盐水稀释制成含107cfu/ml的悬浮液，用喷雾器喷洒猕猴桃植株叶片及枝干；对照组用商品化农药“农用链霉素”作为药剂喷洒猕猴桃植株叶片及枝干。每隔四周喷施一次，于第二年4月溃疡病高发期进行调查统计。统计结果如下表3所示：表3田间防效试验结果表中可以看出假单胞菌cctccm2016556发病率与病情指数均低于农用链霉素，表明该拮抗菌田间防效效果优于农用链霉素，对猕猴桃溃疡病有一定的防效效果。<110>四川省自然资源科学研究院<120>一种防治猕猴桃溃疡病的假单胞菌菌株及其应用<160>1<210>1<211>1405<212>dna<213>假单胞菌（pseudomonassp.）<400>1ggtaccgtcctcccgaaggttagactagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtg60acgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattac120tagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggtttt180atgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtg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