本发明涉及一种节杆菌新菌株，可降解纤维素，特别涉及该菌株的在以农业及养殖业的废弃物为原料生产农家肥中的用途，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：农作物秸秆如稻草、麦秆和甘蔗渣等富含纤维素作物是一种重要的可再生资源，全世界每年秸秆产量约为22亿吨(kimetal.，2004)，我国每年约产农作物秸秆7亿吨(徐杰等，2008)。农作物秸秆除小部分用于堆肥和作为畜禽饲料外，大部分被随意烧毁，这不仅浪费了宝贵的资源，而且污染了环境(chengetal.，2013)。目前，微生物法降解农作物秸秆以其最经济、最有效的优势而为人们广泛关注(顾文杰等，2012；张建峰等，2016)。在过去的几十年里，国内外学者陆续发现了一些能够降解纤维素的微生物，如真菌类中的毛霉属(文自兰等，2015)、白腐菌(doddapanenietal.，2005)等，放线菌类中的链霉菌属(邓辉等，2013；冯红梅等，2016)、小单胞菌属(kasusaretal.，2011)等，细菌类中的芽孢杆菌属(王贤丰等，2015)、假单胞菌属(尚晓瑛等，2012)等。在微生物降解纤维素的实际应用中，常常采用纤维素降解混合菌群的方式，以堆肥或沤肥的形式来降解农作物秸秆中的纤维素(梁东丽等，2009)，该过程周期较长且降解不充分。近些年来，虽然人工诱变和基因修饰(fujiietal.，2013)等生物工程技术逐渐应用于纤维素降解菌改造中以提高菌株的产纤维素酶能力，但是获得的菌株仍然存在产酶量少、酶活力低等问题。因此，筛选新型纤维素降解微生物，寻找最佳纤维素降解途径，遗传改造已有纤维素降解菌显得尤为重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种高产纤维素酶、降解性能强的细菌，该菌株可用于以农业及养殖业的废弃物为原料生产农家肥。本发明采用选择性培养基，通过定向驯化的方法，从恩施土家族苗族自治区原始森林的腐木中筛选分离得到一株高产纤维素酶细菌，该菌株被命名为hw-17，属一种节杆菌(arthrobacteroryzae)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2017年3月30日，保藏编号为：cctccno：m2017156；该菌株的16srdna序列如seqidno.1所示。本申请所提供的hw-17菌株作为单一的纤维素降解菌对纤维素的降解能力虽然抵不上混合菌系对含纤维素样品的降解能力，但将该hw-17菌株接种至含猪粪或鸡粪的纤维素样品中(v/w＝1∶1)，含纤维素的秸秆亦得到了有效的降解，而目前本领域中未见其他节杆菌对含鸡粪或猪粪的混合纤维素样品中纤维素降解效果的报道。因而该菌可用于堆肥，可用于工业上以鸡粪或猪粪、农作物秸秆、蔬菜烂叶等作为原料生产有机肥。此外，该hw-17菌株的生长特性及产纤维素酶特性非常清楚，因而该hw-17菌株既可作为工业上生产纤维素酶的候选菌株，还可用于商业上生产单一的纤维素酶。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。菌株的筛选及培养本申请中以从湖北省恩施州七姊妹山采集到的腐木为筛选菌株的材料，采用以羧甲基纤维素钠作为单一碳源的选择性培养基[羧甲基纤维素钠(cmc-na)10.0g/l，kh2po42.0g/l，nh4cl5.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，ph7.0-7.2]，将腐木加入该选择性培养基中，于30℃、200r/min下驯化7d。将驯化后的菌液逐级稀释，取少量不同稀释度的菌液均匀涂布于该选择性固体培养基上，于30℃下培养。挑取水解圈大的菌落进行划线稀释6次，以此得到纯化的且纤维素降解能力强的单菌落。所筛选到的菌株生理生化特性如下：objectsresultsobjectsresults革兰氏染色+α-乳糖利用-vp试验-蔗糖利用+甲基红试验-d-木糖利用-淀粉水解试验+麦芽糖利用+柠檬酸盐试验-海藻糖利用+吲哚试验-鼠李糖利用+产氨试验+山梨醇利用-h2s试验-甘露醇利用+尿素水解试验-甲醇利用+h2o2接触试验+乙醇利用+明胶液化试验-草酸利用-丙二酸盐试验-甘油利用-葡萄糖利用+酒石酸钾钠利用-注：+，阳性发应；-，阴性反应该菌株的生长特性如下：①氮源的偏好：在胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸出物、干酪素、kno3、nano2、nh4cl和甘氨酸这8种氮源中，arthrobacteroryzaehw-17对有机氮源的利用最好，特别是胰蛋白胨②碳源的偏好：在葡萄糖、蔗糖、淀粉、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、乙醇、甲醇、纤维素这9种碳源中，arthrobacteroryzaehw-17对乙醇的利用最好③最适生长ph：在ph为3、4、5、6、7、8、9或10下，arthrobacteroryzaehw-17在ph为7下生长得最好。④最适生长温度：arthrobacteroryzaehw-17能在15-50℃范围下生长，且在30℃或35℃下生长得最好。菌株的鉴定与保藏采用tiangendna提取试剂盒(天根生化科技，北京)提取细菌总dna。使用细菌通用引物(lane,1991)来扩增菌株hw-1716srdna基因。pcr产物经纯化后送于武汉擎科创新生物科技有限公司测序。将测得的16srdna序列上传至ncbi中与已知的16srdna比对，使用mega6(tamuraetal.，2013)软件构建系统进化树，其16srdna序列如seqidno.1所示。对序列进行同源性分析，判断其为节杆菌(arthrobacteroryzae)，将其命名为hw-17菌株。并将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2017年3月30日，保藏编号为：cctccno：m2017156。菌株的性能实验及分析本申请所提供的hw-17菌株在含羧甲基纤维素钠的培养基(cmc培养基)中培养7天的过程中，纤维素酶活最高可达18.55u/ml。在这种单一碳源的培养基中，hw-17菌株表达的纤维素酶活明显较其他人筛选到的纤维素降解菌株产生的纤维素酶活(2.80u/ml)高。因此，单就产纤维素酶而言，本申请所提供的hw-17菌株具有较大的应用前景。本申请提供的hw-17菌株能够利用包菜叶、水稻叶、香樟叶、苹果皮或杂木屑中有机物进行生长，且对苹果皮和包菜叶的利用效果最好。因此，hw-17菌株可以作为合适的菌株以降解难以处理的果蔬，因而在果蔬残渣发酵生产农家肥这一领域具有巨大应用价值。具体实验如下：分别取1g经液氮研磨后的苹果皮(apple)、水稻叶(rice)、香樟叶(camphor)、包菜叶(cabbage)或杂木屑(sawdust)加入至基础培养基中作为碳源以取代cmc-na，对照组为分别含上述5种未经液氮研磨的纤维素样品。将菌株hw-17接种至上述10种培养基中，30℃、200r/min下培养3d后测定d600值和纤维素酶活。结果如下：菌株hw-17在5种未经研磨的纤维素样品的培养基里呈现出如下的生长顺序:包菜叶>水稻叶>香樟叶>苹果皮>杂木屑，而在5种经液氮研磨的纤维素样品的培养基里呈现出以下生长顺序：苹果皮>包菜叶>水稻叶>香樟叶>杂木屑，且均较对照组的生物量高。此外，实验组和对照组中的最大纤维素酶活分别为4.79u·ml-1和6.69u·ml-1，且两者均在含苹果皮的培养基里取得。研磨含纤维素的样品能够增大样品与菌株的接触面积，这样有助于菌株更好地降解纤维素。由此可见，研磨后的纤维素样品更适于菌株hw-17代谢利用，且产生的纤维素酶活更高。针对农业生产上产生的大量农作物秸秆，如水稻秸秆等，当水稻秸秆与猪粪或鸡粪以合理的比例混合后，接种本申请所提供的hw-17菌株至两种混合纤维素样品中发酵20天，两种混合样品中的水稻秸秆明显得到降解。此外，在猪粪-水稻混合样品与鸡粪-水稻混合样品中检测到最大纤维素酶活为7.38u/ml和9.71u/ml。因此，hw-17菌株能够最为合适的堆肥菌株以降解农作物秸秆，甚至可以用于工业生产有机农家肥。具体试验方法如下：称取20g烘干的鸡粪(chicken)或猪粪(pig)，分别加入至盛有20g磨碎的水稻叶片(rice)的锥形瓶中，1×105pa下灭菌20min。吸取20ml菌株hw-17种子溶液(d600＝1)接种至上述样品中并混匀，然后置于30℃下培养。每隔2d，收集浸出液，测定纤维素酶活。此外，将浸出液进行梯度稀释，吸取0.1ml稀释度为10-6的稀释液，均匀涂布于cmc-na固体平板上，30℃下培养24h后确定平板上单菌落。结果如下：菌株hw-17在rice-chicken混合样品里堆肥发酵12d后，纤维素酶活最大(9.71u·ml-1)；在rice-pig混合样品里发酵14d后，纤维素酶活最大(7.38u·ml-1)。纤维素酶活变化趋势与样品里菌株数量变化趋势一致，且同一时刻下rice-chicken混合样品里纤维素酶活均高于rice-pig混合样品里纤维素酶活。复合微生物菌剂发酵含鸡粪或猪粪纤维素样品产生的纤维素酶的变化率与该结果一致。此外，实际观测到的鸡粪和水稻叶片混合样品较猪粪和水稻叶片混合样品降解得更厉害。猪粪和水稻的混合样品(c/n＝24.7)较鸡粪和水稻的混合样品(c/n＝19.7)的碳氮比高，前者更适于菌株hw-17的代谢。在堆肥发酵的初期，菌株hw-17优先利用鸡粪或猪粪里的有机物以维持自身的生长和繁殖，待混合样品营养度降低时，菌株hw-17开始利用水稻叶片里的纤维素。<110>：中南民族大学<120>：一株降解纤维素的节杆菌hw-17菌株及其用途<160>：1<210>：1<211>：1421<212>：dna<213>：节杆菌（arthrobacteroryzae）<400>：1gggggggcgtctaaatgcagtcgaacgatgatgcccagcttgctgggtggattagtggcg60aacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttaactctgggataagcctgggaaactgg120gtctaataccggatatgactcctcatcgcatggtggggggtggaaagctttttgtggttt180tggatggactcgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggcttaccaaggcgacgacg240ggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactccta300cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcg360tgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtagggaagaagcgaaagtgacg420gtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcg480caagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgccg540tgaaagtccggggctcaactccggatctgcggtgggtacgggcagactagagtgatgtag600gggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatg660gcgaaggcaggtctctgggcattaactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaaca720ggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattc780cacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaag840gctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattc900gatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatggaccggaccgggctggaaacagtc960cttcccctttggggctg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