一种姜黄属植物总倍半萜及三种倍半萜单体及制备方法和用途与流程

本发明属医药食品
技术领域：
，具体涉及一种以姜黄属植物为原料制备的总倍半萜及三种倍半萜单体化合物及制备方法和其在制备具有抗糖尿病效果的药物、保健食品和功能食品等产品中的应用。
背景技术：
：姜黄属常用中药包括姜黄、郁金和莪术。姜黄为植物姜黄(curcumalongal.)的干燥根茎；郁金为温郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)，姜黄(curcumalongal.)，广西莪术(curcumakwangsiensiss.g.leeetc.f.liang)或蓬莪术(curcumaphaeocaulisval.)的干燥块根，前两者分别习称“温郁金”和“黄丝郁金”，其余按性状不同习称“桂郁金”或“绿丝郁金”；莪术为姜科植物蓬莪术(curcumaphaeocaulisval)，广西莪术(curcumakwangsiensiss.g.leeetc.f.liang)或温郁金(curcumawenyuiny.h.chenetc.ling)的干燥根茎，后者习称“温莪术”。中医认为，姜黄属中药具有行气破血、消积止痛、清心解郁等功效。自20世纪80年代以来，国内外又从基础研究及临床应用等方面对该属中药做了大量研究工作，发现姜黄属植物的根茎和块根主要含有倍半萜(挥发油)类和姜黄素类成分，药理活性以抗肿瘤和抗炎活性为主，较少见到姜黄属植物中倍半萜的抗糖尿病活性的报道。我们的研究发现，姜黄属植物中的总倍半萜具有良好的增加葡萄糖消耗的活性，其中主要活性物质为莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮，本申请提供了总倍半萜和三种单体倍半萜及制备方法和其在抗糖尿病方面的用途。技术实现要素：本发明的目的是提供具有抗糖尿病活性的一种姜黄属植物总倍半萜提取物，通过以下步骤实现：将姜黄属植物的根制成饮片后，按药材/溶剂(重量/体积比)加入8-12倍量有机溶剂，室温浸提或回流提取2-3次，减压浓缩得浸膏，用适量水将此浸膏混悬溶解，然后用低极性有机溶剂液液萃取至无颜色变化，回收溶剂，干燥得到该总倍半萜。其中提取有机溶剂包括70-95％乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷；萃取所用的低极性有机溶剂包括石油醚、己烷、二氯甲烷或三氯甲烷。该总倍半萜提取物中含有多种倍半萜单体，主要包括莪术烯醇(化合物1)、莪术二酮(化合物2)和蓬莪术环氧酮(化合物3)。本发明的另一个目的是提供三种主要倍半萜单体化合物的制备方法，通过以下步骤获得：将总倍半萜提取物再经过硅胶色谱柱纯化，有机溶剂梯度洗脱，可得到三个含主要成分的部分，然后分别用有机溶剂结晶得到莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮的纯品。其中，梯度洗脱使用的有机溶剂为石油醚或己烷：乙酸乙酯或丙酮体系，梯度范围为50-70:1、20-40:1、10-20:1，分别相应地制备得到化合物2、3、1的粗品。结晶所用的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、己烷及其组成的二相或三相系统。以上所述的姜黄属植物，包括温郁金curcumawenyujin、姜黄curcumalonga、广西莪术curcumakwangsiensis、蓬莪术curcumaphaeocaulis、郁金curcumaaromatica等姜黄属常用植物。通过多种波谱技术测试了莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮的性质，包括uv、ir、ms及nmr(1d及2dnmr)以及x-射线单晶衍射，在对波谱信息进行详细的解析后确证结构为莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮。结构如下：化合物(1)：莪术烯醇curcumenol的结构如下：化合物(2)莪术二酮curdione的结构如下：化合物(3)蓬莪术环氧酮zederone的结构如下：本发明的再一个目的是提供所述的总倍半萜及莪术烯醇(化合物1)、莪术二酮(化合物2)和蓬莪术环氧酮(化合物3)在抗糖尿病方面的用途，包括制备抗糖尿药物、抗糖尿保健食品或功能食品等产品中的应用。本研究选取了人肝肿瘤细胞系hepg2对总倍半萜、莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮的抗糖尿病活性的研究，结果显示总倍半萜及莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮能有效增加人肝癌细胞系hepg2的葡萄糖消耗。其中总倍半萜(10μg/ml)的葡萄糖消耗增加百分率为64.1，莪术烯醇(10μm)、莪术二酮(10μm)和蓬莪术环氧酮(10μm)的葡萄糖消耗增加百分率为47.0、74.0、57.0，表明他们具有明显的抗糖尿病活性。本发明提供的具有抗糖尿病活性的总倍半萜及莪术烯醇(化合物1)、莪术二酮(化合物2)和蓬莪术环氧酮(化合物3)，通过添加一定辅料，可以应用于制备抗糖尿病药物、保健食品和功能食品。本发明开发了姜黄属植物中倍半萜的抗糖尿病新用途，拓展了姜黄属植物的药物作用范围，为推广利用和深加工中药材提供依据，并提供了新的应用方向。附图说明图1是莪术烯醇的1hnmr谱(500mhzind6-dmso)。图2是莪术烯醇的13cnmr谱(125mhzind6-dmso)。图3莪术烯醇的质谱。图4是莪术二酮的1hnmr谱(500mhzincdcl3)。图5是莪术二酮的13cnmr谱(125mhzincdcl3)。图6是莪术二酮的质谱。图7是蓬莪术环氧酮的1hnmr谱(500mhzincdcl3)。图8是蓬莪术环氧酮的13cnmr谱(125mhzind6-cdcl3)。图9蓬莪术环氧酮的质谱。具体实施方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。实施例1干燥的温郁金块根10kg，打粉，用80l的95％乙醇溶液室温浸提两次，每次5天。合并提取液，蒸至无醇味得总浸膏210g。总浸膏用2l的水分散，用石油醚等体积萃取，得到石油醚萃取部分clp，干燥后得到总倍半萜(98g)。再将总倍半萜上200～300目硅胶，用石油醚-乙酸乙酯系统梯度洗脱(1:0-0:1)，收集石油醚：乙酸乙酯50:1、20:1、10:1洗脱流份，再用正己烷-丙酮系统结晶即可分别得到化合物2(2g)、化合物3(400mg)和化合物1(4g)。实施例2干燥的郁金根茎8.5kg，打粉，用85l的乙酸乙酯回流提取3次，每次4h，过滤后合并提取液，得到总浸膏900g。总浸膏用2l的水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂后得到氯仿部位，干燥后得到总倍半萜180g。将氯仿部位浸膏用200-300目硅胶柱色谱分离，石油醚-丙酮(1:0-1:1)梯度洗脱，收集其中的石油醚-丙酮(60:1)、(30:1)和(15:1)部位，分别得到化合物2、化合物3和1的粗品。然后用二氯甲烷-甲醇系统重结晶，可分别得到化合物2(3g)、化合物3(100mg)和1(1g)的纯品。实施例3干燥的姜黄粗粉5kg，粉碎后加入40l二氯甲烷，80摄氏度回流提取两次，第一次2小时，提取液过滤后补加40l二氯甲烷继续回流提取1小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏270g，用2l水将此浸膏混悬溶解，用正己烷等体积萃取，干燥后得到总倍半萜110g。实施例4干燥的蓬莪术药材饮片9kg，用8倍量的环己烷回流提取2次，每次2h；合并2次提取液，减压回收溶剂，得到环己烷部位135g，即为总倍半萜部位。再将总倍半萜上100目硅胶，用己烷-乙酸乙酯系统梯度洗脱(1:0-0:1)，收集己烷：乙酸乙酯60:1、25:1、15:1洗脱流份，再用二氯甲烷结晶即可分别得到化合物2(2g)、化合物3(600mg)和化合物1(3g)。实施例5干燥的蓬莪术药材饮片2kg，用超临界co2设备进行萃取，萃取温度为50℃，提取2次，每次2h；合并2次提取液，减压回收溶剂，得到总倍半萜部位35g。实施例6莪术烯醇、莪术二酮和蓬莪术环氧酮的波谱数据见表1。表1.莪术烯醇(1)(d6-dmso)、莪术二酮(2)(cdcl3)和蓬莪术环氧酮(3)的1h(500mhz)和13c(125mhz)nmr数据及信号归属实施例7抗糖尿病活性研究总倍半萜、莪术烯醇(1)、莪术二酮(2)和蓬莪术环氧酮(3)的抗糖尿病活性研究方法：hepg2细胞用含10％胎牛血清的高糖型dmem培养基于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育，隔天更换新鲜培养液，2-3天传代1次。实验时，hepg2细胞接种于96孔板，并设无细胞空白对照孔。待细胞生长至80-90％融合，弃去原培养基，用pbs缓冲液洗2遍，换上含0.2％bsa的无血清1640培养液，分组加药。设dmso对照组，met(盐酸二甲双胍)对照组(终浓度为1mm)和不同受试组。作用24h后，用葡萄糖氧化酶法测定每孔培养液的葡萄糖含量。每孔培养液葡萄糖消耗量＝无细胞空白孔培养液葡萄糖含量－每孔培养液葡萄糖含量，每组设3个以上复孔。相同实验重复4次。葡萄糖含量测定后，细胞用10％三氯醋酸固定1小时，用双蒸水洗涤并干燥后，每孔加入100微升srb溶液(4mg/ml)，室温染色20分钟，1％醋酸洗涤，干燥。每孔加入100微升10mmtris溶液使srb溶解。酶标仪检测各孔od值(检测波长：515nm)，用于反映细胞生长状况，以矫正细胞接种数目及受试物毒性等综合因素造成的实验误差。最后计算各组葡萄糖消耗量与溶剂对照组比较的增加百分率。数据用均数±标准差表示，组间比较采用t-检验。结果：阳性药met和受试物作用于人肝hepg2细胞24h后，与溶剂对照组比较，1mmmet促进葡萄糖消耗的百分率为67.6％(p<0.01)；10μm化合物1、2和3以及总倍半萜10μg/ml增加葡萄糖消耗百分率分别为47.0％(p<0.01)，74.0％(p<0.05)，57.0％(p<0.05)以及64.1％(p<0.05)，具体数据见表2.表2.受试物对人肝hepg2细胞24h葡萄糖消耗的影响(n＝4)组别受试物浓度葡萄糖消耗(mm)葡萄糖消耗增加百分率(％)dmso0.5％v/v1.07±0.16-met1mm1.79±0.18**67.6110μm1.57±0.21**47.0210μm1.86±0.61*74.0310μm1.68±0.41*57.0总倍半萜10μg/ml1.76±0.49*64.1实施例8总倍半萜片剂的制备总倍半萜10.0g与淀粉180g混匀，加10％淀粉浆4g制成软材，加入硬脂酸镁0.04g，干淀粉3.6g混匀后压制成2000片，即得。每片含总倍半萜5mg。实施例9总倍半萜滴丸剂的制备精密称取0.50g的总倍半萜，加适量无水乙醇，微热溶解，加人到3.75g的peg4000熔融液中，搅拌混合均匀，直至乙醇挥尽，静置于90℃水浴上保温30min。待气泡除尽，在保温的条件下，用1.6mm的注射器吸取熔融物,控制滴距在6～8cm范围内，冷却高度为15cm，滴人5℃冷凝液液体石蜡中待冷凝完全，倾去冷凝液，收集滴丸，沥净和用滤纸除去滴丸上的冷凝液，即得。每粒滴丸含总倍半萜5mg。实施例10莪术烯醇片剂的制备莪术烯醇14.0g与淀粉90g混匀，加10％淀粉浆2g制成软材，加入硬脂酸镁0.02g，干淀粉1.8g混匀后压制成2000片，即得。每片含莪术烯醇7mg。实施例11莪术二酮片剂的制备莪术烯醇10g与淀粉90g混匀，加10％淀粉浆2g制成软材，加入硬脂酸镁0.02g，干淀粉1.8g混匀后压制成2000片，即得。每片含总倍半萜5mg。当前第1页12