从喙果皂帽花中提取的阿朴啡生物碱及提取方法与流程

本发明涉及一种天然的植物提取物，具体涉及一种从喙果皂帽花茎中提取的阿朴啡生物碱及提取方法。

背景技术：

喙果皂帽花（dasymaschalonrostratum）是番荔枝科喙果皂帽花属（dasymaschalon）植物。近年来药理筛选表明其具有很好的生物活性。例如周立冬等（喙果皂帽花的a环具酮基黄酮类化合物和氧化阿朴咔类生物碱【j】.中国中药杂志，2001.26（1）：39）从其茎中分离得3个a环具酮基黄酮类化合物和1个氧化阿朴咔类生物碱，均具有抗肿瘤活性。宋煌旺、宋鑫明等（喙果皂帽花挥发油gc-ms分析及活性研究，中国实验方剂学杂志，第19卷第16期，2013年8月）经过gc-ms分析喙果皂帽花叶挥发油得到91个化合物，坚定了73个化合物，占总含量的90.25%，主要为烯类化合物。喙果皂帽花叶的挥发油中含有很多活性成分，β-榄香烯能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞核酸合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，而且能增强肿瘤的免疫原性。α-石竹烯可强烈诱导小鼠肝和小肠中的解毒酶谷胱甘肽s-转移酶活性而对化学致癌起抑制作用。

对喙果皂帽花进一步的化学成分分离、结构鉴定和物质用途的工作还需继续进行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种从喙果皂帽花中提取的阿朴啡生物碱及提取方法。

实现本发明目的的技术方案是一种由下述式（ⅰ）表示的阿朴啡生物碱：

（ⅰ）。

上述阿朴啡生物碱从喙果皂帽花中提取，包括以下步骤：

①将自然风干的喙果皂帽花的茎粉碎后用乙醇浸泡回流提取，将收集到的回流液合并、减压蒸馏，得到乙醇总浸膏，然后将上述乙醇总浸膏均匀分散于蒸馏水中，用石油醚进行萃取，得到石油醚部位浸膏；对石油醚萃取后的水相进行酸碱处理，先用hcl调节水相ph值为1～2，用乙酸乙酯进行萃取，得到非生物碱层的乙酸乙酯部位浸膏；接着用naoh调节乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值为10～11，用氯仿进行萃取，得到生物碱层氯仿部位浸膏；

②将步骤①得到的生物碱层氯仿部位浸膏经过硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇溶剂体系进行梯度洗脱，收集、浓缩、合并相同流分；

③将步骤②硅胶柱分离得到的第二大段组份依次进行硅胶柱色谱分离和sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析分离，最后经高效液相色谱分离得到目标提取物阿朴啡生物碱。

上述步骤③中硅胶柱色谱分离使用的溶剂体系为氯仿∶甲醇=10∶1，sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析分离使用的溶剂体系为氯仿∶甲醇=1∶3，高效液相色谱分离使用的流动相体系组成为60%乙腈和40%水。

本发明具有积极的效果：本发明从喙果皂帽花中提取获得一种阿朴啡生物碱，该化合物对hiv-1型病毒具有较好的抑制活性。

附图说明

图1为本发明提取的阿朴啡生物碱的核磁共振氢谱图。

图2为本发明提取的阿朴啡生物碱的核磁共振碳谱图。

图3为本发明提取的阿朴啡生物碱的核磁共振无畸变极化转移增强谱（dept）。

图4为本发明提取的阿朴啡生物碱的氢氢相关谱(h-h-cosy谱)。

图5为本发明提取的阿朴啡生物碱的hsqc谱。

图6为本发明提取的阿朴啡生物碱的hmbc谱。

图7为本发明提取的阿朴啡生物碱的x-ray单晶衍射图。

图8为本发明提取的阿朴啡生物碱的高分辨电喷雾电离质谱（hresims）图。

具体实施方式

（实施例1）

本发明的从喙果皂帽花中提取的阿朴啡生物碱的分子式为c20h20n2o7，分子量为401.13443，外观为无色油状液体，易溶于氯仿、乙酸乙酯；其结构式如下式（ⅰ）：

（ⅰ）。

从喙果皂帽花中提取上式阿朴啡生物碱的方法包括以下步骤：

①将22.5kg自然风干的喙果皂帽花的茎粉碎后，用体积分数为75%的乙醇浸泡回流提取3次，每次5天，将收集到的回流液合并、减压蒸馏，得到920g的乙醇总浸膏，然后将上述乙醇总浸膏均匀分散于3.0l蒸馏水中，用石油醚（3×3.5l）进行萃取，得到石油醚部位浸膏（260g）；对石油醚萃取后的水相进行酸碱处理，先用1mol/l的hcl调节水相ph值为1～2，用乙酸乙酯（4×4.0l）进行萃取，得到非生物碱层乙酸乙酯部位浸膏（430g）；接着用1mol/l的naoh调节乙酸乙酯萃取后得到的水相的ph值为10～11，用氯仿（5×4.0l）进行萃取，得到生物碱层氯仿部位浸膏（35g）。

本实施例所用的喙果皂帽花的茎采自海南昌江县霸王岭国家森林保护区，标本存放于海南师范大学热带药用植物化学省部共建教育部重点实验室。

②将步骤①得到的35g生物碱部位的氯仿层浸膏经过硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇溶剂体系，按照100∶0～0∶100（v/v）的梯度进行洗脱，每500ml收集流分，浓缩流分，通过tlc（薄层色谱）检测，合并相同流分。

③将步骤②硅胶柱分离得到的第二大段组份依次进行硅胶柱色谱分离（溶剂体系氯仿∶甲醇=10∶1，v/v）和sephadexlh-20葡聚糖凝胶柱层析（溶剂体系为氯仿∶甲醇=1∶3，v/v）分离后，最后经高效液相色谱使用流动相60%乙腈和40%水（流动相中含0.1%二乙胺）分离得到目标提取物阿朴啡生物碱9.6mg。

目标提取物阿朴啡生物碱产品分析：

分离得到的目标提取物的旋光值为[α]²⁵d-158.2（检测仪器为上海朴贝公司的jascop-1020型号的旋光仪）。

阿朴啡生物碱的核磁共振氢谱图（布鲁克(北京)科技有限公司av-iii400mhz型号核磁共振仪，以下检测也使用该台仪器，溶剂cdcl3，tms内标，400/100hz）见图1。

阿朴啡生物碱的核磁共振碳谱图（溶剂cdcl3，tms内标，100mhz）见图2。

化合物的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)数据如下表1。

表1化合物1的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,cdcl3)数据(ppm)

阿朴啡生物碱的核磁共振无畸变极化转移增强（dept）谱见图3，溶剂cdcl3。

阿朴啡生物碱的氢氢相关谱(h-h-cosy谱)见图4，溶剂cdcl3。

阿朴啡生物碱的hsqc谱见图5，溶剂cdcl3。

阿朴啡生物碱的hmbc谱见图6，溶剂cdcl3。

阿朴啡生物碱的x-ray衍射见图7。

阿朴啡生物碱的高分辨电喷雾电离质谱图（q-traplc/ms/mssystem质谱仪，esi源）见图8，图中[m+h]⁺的calc.mass—理论分子量为401.13445，实测分子量401.13443。

总结：根据化合物的图8高分辨质谱数据401.13443[m+h]⁺，推算出该化合物的分子式为c20h20n2o7，不饱和度为12。

¹hnmr谱中显示，在低场区有3个单峰的质子信号δh6.51(1h,s,h-10),6.00(1h,s,och2o),5.84(1h,s,och2o),3个甲氧基信号δh4.02(3h,s,ch3o-3),3.93(3h,s,ch3o-9)和3.94(3h,s,ch3o-11),1个次甲基信号δh3.71(1h,dt,j=14.8,2.0hz,h-6a),此外，还有3个亚甲基信号δh3.35(1h,m,h-5),2.87(1h,m,h-5),2.83(2h,m,h-4),2.78(1h,dd,j=14.8,4.0hz,h-7),2.44(1h,t,j=14.8hz,h-7)。¹³cnmr和dept显示20个碳信号，包括2个苯环和8个sp³杂化碳(3个甲氧基，4个亚甲基，1个次甲基碳)。分析光谱数据可知该化合物是一个阿朴啡类生物碱化合物。结合¹h-¹hcosy,hsqc和hmbc谱分析可以进一步证实该化合物是一个阿朴啡类生物碱化合物。在hmbc谱中，通过h-och3-3与c-3、h-och3-9与c-9、h-och3-11与c-11的相关确定三个甲氧基分别连在c-3、c-9和c-11位。

从化合物hresims401.13443[m+h]⁺判定化合物中含两个氮原子，且c-8位少了一个质子氢信号，推测c-8连有一个硝基。以上推测通过hmbc谱h-10,h-7与c-8的相关得到确认。同时，通过缓慢的挥发甲醇溶剂得到该化合物的单晶，图7的x-ray衍射清晰证实了该化合物中c-8位连有一个硝基。通过x-ray衍射和左旋旋光值[α]²⁵d-158.2(c0.25,meoh)确定该化合物的绝对构型为6ar.因此，该化合物是一个含有硝基的阿朴啡生物碱，是一种天然化合物，结构式如上式（ⅰ）。发明人将其命名为dasymaroinea。

（试验例1、化合物的体外抗hiv活性评价）

试验方法：取实施例1分离得到的阿朴啡生物碱对hiv-1进行活性测试。以hiv-1病毒感染的mt4细胞为实验模型，以病毒引起合胞体的产生为评价指标，观察药物的作用。

将8×10⁵/mlc8166细胞50μl/孔接种到含有100μl/孔梯度倍比稀释药物的96孔细胞培养板上，然后加入50μl的hiv-1iiib稀释上清，1300tcid50/孔(tcid5050%tissuecultureinfectivedose，即感染50%培养细胞所需病毒量)。设3个重复孔，同时设置不含药物的正常细胞对照孔。置37℃，5%co2培养箱内培养3天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。ec50(50%effectiveconcentration)为抑制合胞体形成50%时的化合物浓度。mtt法测定细胞活性，确定cc50值。azt(3ꞌ-azido-3ꞌ-deoxythymidine)为阳性药物对照。

试验结果如下：

上表中：^acc50:半数细胞毒性浓度(50%cytotoxicconcentration)。

^bec50:半数有效浓度(50%effectiveconcentration)。

^cti治疗指数(therapeuticindex)=cc50/ec50。

^dazt(3ꞌ-azido-3ꞌ-deoxythymidine)为阳性对照。

试验结果表明该化合物有一定的细胞毒性，对hiv-1型病毒具有较好的抑制活性，ec50为4.50μm，治疗指数(ti)为6.38。