一种与巴贝虫病患血清特异性结合的多肽片段及其应用的制作方法

本发明涉及生物医学及临床应用技术领域，具体涉一种与巴贝虫病患血清特异性结合的多肽片段及其氨基酸序列及其应用。

背景技术

现有技术公开了巴贝虫病(babesiosis)是由寄生于红细胞内的原虫—-巴贝虫感染引起的新发人兽共患病。研究显示，该疾患主要由节肢动物蜱叮咬宿主后通过吸血传播，也可以通过输血和母婴传播。临床实践显示，感染巴贝虫后，根据宿主自身的免疫状态和虫种的不同，可表现为无症状、疟疾样症状和凶险性症状；免疫健全者感染巴贝虫一般症状为疲惫、发热、头痛、寒战、盗汗、贫血、食欲不振、肌痛、关节痛等；而严重症状则包括黄疸、血红蛋白尿、脾肿大、肾功能衰竭等，多数发生于免疫缺陷病人，如老年人、hiv感染者、脾切除病人和癌症患者等。

目前，对于巴贝虫病的诊断检测中，最经典的方法为显微镜观察姬姆萨染色的血涂片或骨髓涂片，以发现红细胞内寄生的虫体为诊断依据。该方法是巴贝虫病诊断的金标准，但该方法存在操作复杂、费时、费力，容易漏检，而且对镜检人员和设备的要求较高等缺陷；核酸检测通常采用聚合酶链式反应(pcr)和实时定量pcr(real-timepcr)技术对血液中巴贝虫dna进行检测，具有高特异性和高敏感性，但操作复杂成本高并对实验人员和设备要求高；免疫学检测可用于巴贝虫病血清学诊断，该方法具有成本低廉、检测速度快、适用于快速高通量的筛查诊断。最近的研究显示巴贝虫的虫体表面蛋白可以用于巴贝虫病的血清学检测，其中裂殖子表面蛋白bmsa是具有应用前景的诊断标识抗原之一。

bmsa是田鼠巴贝虫裂殖子表面的一种抗原，分子大小为43kda，免疫电镜证明了bmsa蛋白定位于裂殖子表面，且向虫体寄生的红细胞内分泌和膜转移。研究显示bmsa可激活宿主免疫力，诱导出保护性免疫反应，抑制田鼠巴贝虫对红细胞的入侵；同时，巴贝虫病患血清可以特异性识别全长bmsa。有研究显示bmsa可作为诊断抗原，以胶体金、elsia等免疫学方法检测患者血清中的特异性抗体用于巴贝虫病的诊断。目前，bmsa制备采用虫体纯化及大肠杆菌重组表达，制备工艺复杂，成本高，且活性不稳定；此外，全长bmsa蛋白中部分氨基酸序列已被证实不含有被病人血清识别的抗原表位，所以以全长bmsa蛋白作为血清诊断抗原容易出现交叉反应。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种与巴贝虫病患血清特异性结合的多肽片段，仅含有巴贝虫病患者血清的识别抗原表位的bmsa肽段片段不仅可以提高特异性和敏感性，而且由于分子量减小，仅通过化学合成方法可大量制备，具有生产简单，活性稳定等特点，适宜应用于临床诊断用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术中巴贝虫病的诊断方案的不足，提供具有与患者血清特异性结合的多肽片段及氨基酸序列，进一步用于制备巴贝虫病血清诊断制剂。

本发明所述的具有与患者血清特异性结合的多肽片段及氨基酸序列是对田鼠巴贝虫裂殖子表面蛋白bmsa的结构分析及抗原表位的筛选得到，通过多肽合成所制备。

本发明提供了能与巴贝虫病患者血清特异性结合的多肽片段及氨基酸序列，然而产生本发明的氨基酸序列的方法不受特别的限制。

所述的与巴贝虫病患者血清特异性结合的氨基酸序列，含有序列1所示的氨基酸序列。

本发明通过对田鼠巴贝虫裂殖子表面bmsa的结构与抗原表位分析得到一系列多肽片段，经过多肽合成通过elisa等方法验证筛选到1个与巴贝虫感染小鼠血清及巴贝虫患者血清都能特异性结合的多肽片段，命名为kf-25，其氨基酸序列如序列1所示。

本发明的实施中，制备纯化多肽片段的方法不受特别的限制，但首选方法是多肽合成。

本发明的另一个目的在于提供含有如前所述的多肽片段为成分的巴贝虫病血清诊断试剂。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明通过对巴贝虫裂殖子表面蛋白bmsa的结构与抗原表位分析得到一系列多肽片段，通过多肽合成制备多肽片段，可用于制备巴贝虫病的血清学免疫诊断制剂，本发明能克服巴贝虫病诊断中血涂片虫体漏检与误诊，显著提高巴贝虫病诊断的特异性和敏感性。

附图说明

图1为bmsa蛋白核酸序列。

图2显示了bmsa蛋白信号肽预测。

图3显示了bmsa蛋白跨膜结构预测。

图4显示了bmsa蛋白结构预测。

图5为bmsa蛋白多肽反应性结果。

表1：人工合成bmsa多肽序列。

具体实施方式

实施例1田鼠巴贝虫裂殖子表面抗原bmsa的生物学特性

根据田鼠巴贝虫裂殖子表面抗原bmsa基因序列(如图1所示)推断出的蛋白由326个氨基酸组成(如序列2所示)，大小为35.117kda；以expas软件预测等电点pi为5.21，predgpi软件预测发现302位氨基酸为gpi锚定位点，signalp4.1软件预测n末端24个氨基酸为信号肽(如图2所示)；tmpred软件预测跨膜区段由胞外向胞内，从氨基酸310到326(score2066)(如图3所示)，potparam软件预测阴性荷电氨基酸占53％，阳性荷电氨基酸比例为43％；同源建模预测bmsa三维结构如图4所示。

实施例2田鼠巴贝虫裂殖子表面抗原bmsa的抗原表位分析及验证

根据discotope2.0软件预测田鼠巴贝虫裂殖子表面抗原bmsa的b细胞表位共有6个抗原表位(如表1所示)，采用人工多肽合成的方法对这6段抗原表位进行多肽合成；随后通过间接elisa方法通过感染巴贝虫的小鼠血清对抗原表位进行筛选与鉴定，方法如下：向96孔酶标板中加入100μl/孔coatingbuffer(人工合成bmsa蛋白多肽0.5μg)，湿盒中，4℃过夜包被；移去包被液，pbst洗板，在分别加入1％脱脂奶-pbs室温，封闭1h；分别加入倍比稀释的感染巴贝虫小鼠血清及bmsa免疫后的小鼠血清100μl/孔(1:32001:6400，pbs倍比稀释)，室温、湿盒中孵育1h；向每孔加入100μlhrp标记的goatanti-mouseigg(whole)(1:10001％脱脂奶-pbs稀释)，孵育1h；pbst洗板同上，每孔加入显色液200μl，孵育30min；每孔加入1mh2so450μl，使反应终止，酶标仪od490测定吸光度值。结果显示rbmsa免疫小鼠血清与肽段nk-17和kf-25有较强的反应性，与qk-9和tk-26有相对弱的反应性，田鼠巴贝虫感染小鼠血清识别肽段为kf-25(如图5所示)，说明kf-25肽段是田鼠巴贝虫裂殖子表面抗原bmsa的主要b细胞表位，该多肽片段可用于制备巴贝虫病的血清学诊断制剂。

表1

实施例3酶联免疫吸附试验(elisa)检测巴贝虫病患者血清

向96孔酶标板中加入100μl/孔coatingbuffer(人工合成bmsa蛋白多肽0.5μg)，湿盒中，4℃过夜包被；移去包被液，pbst洗板，在分别加入1％脱脂奶-pbs室温，封闭1h；每孔中分别加入100μl健康人或病人血清(1:400稀释)，阴性对照为健康人血清(1:400稀释)湿盒中室温孵育1h。pbs(含0.05％tween20)洗板后每孔中加入100μl辣根过氧化物酶标记的山羊抗人igg(1:1000稀释)100μl，湿盒中室温孵育1h。pbs(含0.05％tween20)洗板后加入显色液200μl/孔，室温下避光反应30min，最后每孔加入2mh2so450μl终止显色反应，酶标仪490nm测定吸光度，od490读数高于健康阴性对照组人群平均od值3个标准差以上为阳性，结果显示，2份巴贝虫病患者的血清与kf25反应od490的读数(平均值±标准差)为0.21±0.081，呈阳性反应。

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2025