一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法与流程

本发明涉及慢病毒包装技术领域，尤其涉及的是一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法。

背景技术：

慢病毒(lentivirus)载体是以hiv-1(人类免疫缺陷1型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。

慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。由于四质粒系统比三质粒系统在生物安全性上更好一些，所以应用较多。其中，四质粒表达系统除了转运质粒以外，其他三个包装辅助质粒各自携带一些特殊基因，分别为gag基因、rev基因和vsv-g基因。为了提高慢病毒的感染效率和可靠性，通常需要优化三个包装辅助质粒的比例。传统方法是通过检测抽提的质粒浓度，并且以质粒的分子量计算摩尔数。该方法虽然简单易行，但无法对包装质粒做到精确定量，在病毒包装优化试验中，可重复性较差。所以，建立一种简便、准确检测包装辅助质粒的方法，是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的精确性和重复性差的缺陷，提供了一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，其特征在于：包括对三个辅助质粒分别携带的特殊基因设计特异性引物和慢病毒包装辅助质粒的检测，所述的特殊基因为gag基因、rev基因和vsv-g基因，分别对gag基因、rev基因和vsv-g基因设计一对特异性引物，如下表：

优选的，所述慢病毒包装辅助质粒的检测的步骤如下：

s1用pcr扩增出各基因的相应片段；

s2将各基因产物分别构建在t载体上，形成新的克隆质粒；

s3分别将克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

s4根据三个质粒的核酸浓度和重组质粒的分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品；

s5将标准品稀释成一系列浓度梯度，由此可得到一个标准曲线；

s6上机检测待测质粒的具体拷贝数；

s7根据三个包装辅助质粒的具体拷贝数，优化各质粒的比例。

优选的，所述步骤s1)pcr反应体系为：以三个辅助质粒为模板，分别加入到新的pcr管中；在pcr管中，加入相应的上下游引物各2μl；然后依次加入dntp4μl，10×pcrbuffer5μl，用无菌水加至50μl；最后加入高保真dna聚合酶0.25μl。

作为优选，所述步骤s1)pcr反应条件为：预变性95℃/2min；变性95℃/20sec，退火60℃/20sec，延伸72℃/20sec，30个循环；补全延伸72℃/10min。

优选的，所述步骤s2)t载体的连接体系及条件：将pcr产物加入微量离心管中；再加入18-tvector1μl，补去离子水至5μl,混匀；加入5μl(等量)的solutionⅰ,16℃反应30min。

优选的，所述步骤s3)t载体的转化：全量(10μl)加入至100μljm109感受态细胞中，冰上放置30min；42℃加热45sec,再在冰中放置1min；加入890μlsoc培养基，37℃震荡培养60min；在含有x-gal、iptg、amp的l-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

重组t载体的鉴定：挑选白色菌落，使用pcr法确定载体中插入片段的长度大小；

重组质粒的抽提：将阳性克隆送交dna序列分析，选取和保留序列正确的克隆，常规制备dna质粒。

作为优选，步骤s5)所述的一系列浓度梯度可为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²。

本发明提供了一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，包括对三个辅助质粒分别携带的特殊基因设计特异性引物和慢病毒包装辅助质粒的检测，所述的特殊基因为gag基因、rev基因和vsv-g基因，分别对gag基因、rev基因和vsv-g基因设计一对特异性引物。传统方法是通过检测抽提的质粒浓度，并且以质粒的分子量计算摩尔数。该方法虽然简单易行，但无法对包装质粒做到精确定量，在病毒包装优化试验中，可重复性较差。与现有技术相比：本发明是以三个辅助质粒分别携带的特殊基因设计特异性引物，运用荧光定量pcr对包装辅助质粒进行精确定量。通过实验可以获知三个包装辅助质粒的具体拷贝数，为后续优化质粒的比例提供了数据支持，提高了实验准确性和重复性。

附图说明

图1为标准品(含gag基因重组质粒)的扩增曲线；

图2为标准品(含gag基因重组质粒)的标准曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，包括如下步骤：

(1)三个辅助质粒分别携带的特殊基因(gag基因、rev基因和vsv-g基因)设计特异性引物

(2)慢病毒包装辅助质粒的检测

s1用pcr扩增出各基因的相应片段；

s2将各基因产物分别构建在t载体上，形成新的克隆质粒；

s3分别将克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒；

s4根据三个质粒的核酸浓度和重组质粒的分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品；

其中，拷贝数计算公式为：拷贝数＝6.02×1023×核酸浓度÷(dnalength×660)；拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml；

s5标准品可根据拷贝数计算公式稀释成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²，由此可得到一个标准曲线；

s6上机检测待测质粒的具体拷贝数；

s7根据三个包装辅助质粒的具体拷贝数，优化各质粒的比例。

实施例2

一种精确定量慢病毒包装辅助质粒的方法，包括如下步骤：

(1)三个辅助质粒分别携带的特殊基因(gag基因、rev基因和vsv-g基因)设计特异性引物，根据慢病毒基因序列(genbank:d86068.1),分别对gag基因、rev基因和vsv-g基因设计一对特异性引物，如下表：

(2)慢病毒包装辅助质粒的检测

s1用普通pcr扩增出各基因的相应片段:pcr反应体系为：以三个辅助质粒为模板，分别加入到新的pcr管中；在pcr管中，加入相应的上下游引物各2μl；然后依次加入dntp4μl，10×pcrbuffer5μl，用无菌水加至50μl；最后加入高保真dna聚合酶0.25μl。

其中，pcr反应条件为：预变性95℃/2min；变性95℃/20sec，退火60℃/20sec，延伸72℃/20sec，30个循环；补全延伸72℃/10min。

s2将各基因产物分别构建在t载体上，形成新的克隆质粒：t载体的连接体系及条件：将pcr产物加入微量离心管中；再加入18-tvector1μl，补去离子水至5μl,混匀；加入5μl(等量)的solutionⅰ,16℃反应30min。

s3分别将克隆质粒转化到大肠杆菌中，鉴定，培养，抽提质粒：t载体的转化：全量(10μl)加入至100μljm109感受态细胞中，冰上放置30min；42℃加热45sec,再在冰中放置1min；加入890μlsoc培养基，37℃震荡培养60min；在含有x-gal、iptg、amp的l-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；

重组t载体的鉴定：挑选白色菌落，使用pcr法确定载体中插入片段的长度大小；

重组质粒的抽提：将阳性克隆送交dna序列分析，选取和保留序列正确的克隆，常规制备dna质粒。

s4根据三个质粒的核酸浓度和重组质粒的分子量，计算出相应的拷贝数，并且以此为标准品。

其中，拷贝数计算公式为：拷贝数＝6.02×10²³×核酸浓度÷(dnalength×660)；拷贝数的单位为copies/ml，核酸浓度单位为g/ml；

s5标准品可根据拷贝数计算公式稀释成10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³和10²，由此可得到该标准品的扩增曲线和标准曲线，以gag基因的标准品为例，参照附图1和图2；

s6上机检测待测质粒的具体拷贝数；

s7根据三个包装辅助质粒的具体拷贝数，优化各质粒的比例。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。