本发明涉及花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，主要用于水稻籼粳杂种优势利用和水稻分子标记辅助育种研究领域。
背景技术：
：水稻分籼、粳两个亚种，亚种间的杂种一代具有强大的杂种优势，水稻籼粳亚种间杂种优势的利用是进一步提高水稻单产的重要途径之一。但籼粳亚种间杂种一般结实率偏低、籽粒充实度差，这些问题制约了亚种间杂交稻的利用。水稻广亲和基因s5n可克服籼粳生殖障碍，与籼稻或粳稻亚种杂交均能产生正常可育的后代。培育和利用广亲和水稻品种是促进水稻籼粳杂种优势、进一步提高水稻产量的当务之急。但已知的广亲和品种多为农艺性状欠佳的农家品种，不能直接作为亲本使用；而常规育种方法选育优良性状的广亲和品种，需要杂交、回交转育，耗时冗长育种周期长。近年来育种家们育成了甬优12、浙优18、春优84等一批综合性状优良的籼粳亚种间组合，为进一步利用籼粳间杂种优势奠定了良好的基础。水稻花药培养可以快速获得纯系、提高选择效率、有效缩短育种周期。但是水稻花药培养的愈伤组织诱导率及绿苗分化率受基因型影响较大，且目前尚未见到利用生产上推广的籼粳杂交甬优系列品种进行水稻花培获得纯合dh(双单倍体)系、并进一步获得具有广亲和基因s5n的广亲和水稻材料报道。技术实现要素：本发明的目的是针对当前我国水稻生产中缺少广亲和水稻品种的现状，提供利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，方法快速，有效。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法，包括下述步骤：1、花药培养再生植株的获得(1)预处理：新鲜水稻幼穗，75％酒精表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，4℃冰箱中预处理7-10天；(2)诱导培养：预处理结束后，剥去多余叶片和叶鞘，留取发育适宜的带枝小穗，装入无菌烧杯中，先用75％酒精表面消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡10-12min，并用无菌水冲洗3-4次，每次1-2min，最后用无菌滤纸吸干小穗水分；在超净工作台上从颖壳基部1/3处剪断花丝，将花药抖落至诱导培养基上，每个三角瓶约接种80-100个花药，25-28℃暗培养；所述的诱导培养基为n6+2，4-d2.0-3.0mg/l+kt0.5-1.5mg/l+naa2.0-3.0mg/l+蔗糖30-50g/l；(3)分化培养及生根：愈伤组织直径达到2mm时将其转移到分化培养基，25-28℃、1000-1500lx、10-12h/d光照培养直至分化成绿苗；当绿苗长到5cm时，在超净工作台上将绿苗转移到生根培养基上进行生根；所述的分化培养基为：ms+kt2.0-3.0mg/l+6-ba2.0-3.0mg/l+naa0.2-0.8mg/l+iaa0.2-0.8mg/l+蔗糖30g/l；所述的生根培养基的配方包括：1/2ms+naa0.5-1.0mg/l+活性炭0.8-1.0g/l+蔗糖20g/l；2、纯合dh系的获得将根系发育良好的再生植株经过炼苗后大田移植，每个愈伤组织来源的植株单株收种，每个单株获得的种子次年种成株系，通过田间农艺性状调查，选取田间农艺性状纯合株系10-30个。结合室内考种，选取农艺性状优良结实率高丰产性好的dh系5-15个。3、广亲和水稻材料的获得针对广亲和基因s5n设计引物，对选取的dh系进行pcr电泳，筛选具备该基因的植株，即得。以上所述的方法中，优选的，所述的水稻的品种为水稻甬优系列，最佳选择为甬优1540；以上所述的方法中，优选的，新鲜水稻幼穗的获取方法为：于晴天的下午取单核靠边期的幼穗，为保证幼穗新鲜，取样时幼穗留2节及2-3片叶片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室内显微镜下观察花粉母细胞发育时期，花粉发育处于单核靠边期的幼穗叶枕距8-10cm，此时幼穗的颖壳宽度已接近成熟的大小，颖壳呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3－1/2；田间取回的幼穗，在实验室里重新修剪，保留幼穗2叶及1节，75％的酒精表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，放在4℃冰箱中预处理7-10天。以上所述的方案中，优选的，针对广亲和基因s5n设计的正向引物(f1)序列为5’-atcaacccatttcctttcct-3’，反向引物(r1)序列为5’-atacgctcgatcggattaac-3’；进一步的，对有广亲和基因s5n的dh系，能扩增出441bp的片段，而不含有广亲和基因s5n的品种，扩增出的片段为577bp的片段。与现有技术相比，本发明的积极效果为：1、本发明通过水稻花药培养技术，获得花药培养再生植株，可以快速获得纯合的dh双单倍体系。水稻dh系可以作为育种材料，在水稻育种中具有重要意义。2、本发明通过对优良dh系进行广亲和基因s5n的pcr检测，可以快速获得水稻广亲和材料。传统育种回交转育选育广亲和水稻材料需要5-7年才能实现，而应用本发明获得的广亲和水稻材料在水稻花药培养的第二年即可实现。本发明不仅可以大大缩短育种年限、提高育种效率，而且利用本发明方法获得的广亲和dh系能使典型籼稻、粳稻及不育系均正常结实。本发明获得的纯合广亲和dh系可以直接作为亲本材料，为籼粳交杂种优势利用创制了新的种质资源。3.籼粳杂交后代的结实率偏低是籼粳杂种优势利用的制约因素。籼粳杂交水稻品种甬优1540于2015年经第三届国家农作物品种审定委员会第六次会议审定通过，审定编号为国审稻2015040。该品种结实率正常，目前在生产上大面积推广应用。甬优1540花药培养愈伤组织诱导及绿苗分化快，愈伤组织诱导率高达57.8％，绿芽分化率达到43％。利用结实率正常、生产上广泛应用的该品种作为花药培养的材料，获得的dh系比其他材料获得的dh系更容易克服籼粳交杂种结实率低的缺点。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：下面以目前生产上广泛应用的籼粳交组合甬优1540为例作具体说明，其他的水稻甬优系列也能完成本发明，达到高诱导率和分化率的效果。1、花药培养再生植株的获得(1)、水稻材料种植：2015年春季在武汉分期播种甬优1540，大田移栽，以获得足够发育时期适宜的花药。具体分期播种和移栽时间见表1。表1材料播种时期第一期第二期第三期第四期第五期第六期第七期播种3月27日4月7日4月30日5月10日5月25日6月10日6月25日移栽5月10日5月15日5月25日6月5日6月18日7月10日7月20日(2)取材：2015年7月起，分期播种的甬优1540依次进入孕穗期。于晴天的下午取单核靠边期的幼穗，为保证幼穗新鲜，取样时幼穗留2节及2-3片叶片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室内显微镜下观察花粉母细胞发育时期，通过观察发现甬优1540品种花粉母细胞发育处于单核靠边期的幼穗叶枕距在8-10cm，此时幼穗的颖壳宽度已接近成熟的大小，颖壳呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3－1/2。(3)预处理：田间取回的幼穗，在实验室里重新修剪，保留幼穗2叶及1节，75％(体积比)的酒精表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，放在4℃冰箱中预处理7天。(4)诱导培养：预处理结束后，剥去多余叶片和叶鞘，留取发育适宜的带枝小穗，装入无菌烧杯中，先用75％酒精表面消毒30s，再用0.1％(质量比)升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗3-4次，每次1min，最后用无菌滤纸吸干小穗水分。在超净工作台上从颖壳基部1/3处剪断花丝，将花药抖落至诱导培养基上，每个三角瓶接种80-100个花药，28℃暗培养20天三角瓶中开始诱导出愈伤组织，25天愈伤组织直径可达2mm。愈伤组织诱导率为57.8％。(5)分化培养及生根：将直径达到2mm的愈伤组织在超净工作台上转移到分化培养基，28℃、1500lx、12h/d光照培养，7天开始有绿色芽点分化，绿苗分化率为43％。分化培养20天绿苗长到5cm时，在超净工作台上将绿苗转移到生根培养基上进行生根，15天绿苗均能长出发达根系。所述的诱导培养基为：n6+2，4-d2.5mg/l+kt1.0mg/l+naa2.5mg/l+蔗糖50g/l；分化培养基为：ms+kt2mg/l+6-ba2mg/l+naa0.5mg/l+iaa0.5mg/l+蔗糖30g/l；生根培养基为：1/2ms+naa0.5mg/l+活性炭0.8g/l+蔗糖20g/l。2、纯合dh系的获得2015年冬季将根系发育良好的再生植株经过炼苗后带到海南大田移植，每个愈伤组织来源的植株单株收种。每个单株获得的种子2016年种成株系，通过田间农艺性状调查，选取田间农艺性状纯合株系25个。结合室内考种，选取农艺性状优良结实率高丰产性好的dh系12个，dh系编号及室内考种见表2。表2：优良dh系室内考种表3、广亲和水稻材料的获得对上述12个农艺性状优良，丰产性好的优良纯合dh系进行广亲和基因s5n的pcr检测。所述基因检测的正向引物(f1)序列为5’-atcaacccatttcctttcct-3’，反向引物(r1))序列为5’-atacgctcgatcggattaac-3’，对有广亲和基因s5n的dh系，能扩增出441bp的片段，而不含有广亲和基因s5n的品种，扩增出的片段为577bp的片段。所述pcr扩增体系为：10×含mg2+的pcr缓冲液1.5μl，2.5mmol.l-1dntp1.2μl，taqdna聚合酶1u，dh系基因组dna模板1μl，10μmol.l-1的正向引物f10.2μl、10μmol.l-1的反向引物r10.2μl，ddh2o补足体积15μl。所述pcr反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，50℃复性30s，72℃延伸30s，共30个循环；然后72℃延伸5min。所述检测扩增产物带型的方法是进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，然后紫外凝胶成像系统照像。如此筛选出扩增片段为441bp片段，农艺性状优良，丰产性好的5个dh系，即是我们快速选育出的广亲和水稻材料。4、广亲和性鉴定2016年冬选取3个含有广亲和基因s5n的dh系2016dh689、2016dh751、2016dh915分别与籼稻华润2号、粳稻鄂香2号、籼稻r007、不育系144s、不育系y58s杂交，共配制15个杂交组合。2017年春在武汉种植该15个杂交组合f1，成熟时每个组合随机取5株，每株取3穗对结实率进行考种，并统计结实率的平均数。考种结果见表3，由表3可见，含有广亲和基因s5n的dh系2016dh689、2016dh751、2016dh915均能使籼稻、粳稻及不育系正常结实。序列表<110>湖北省农业科学院粮食作物研究所<120>利用花药培养快速选育广亲和水稻材料的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atcaacccatttcctttcct20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atacgctcgatcggattaac20当前第1页12