一种可视化检测食品中肉毒梭菌活菌的方法与流程

本发明涉及基因检测领域，具体来说是一种可视化检测食品中肉毒梭菌活菌的方法。

背景技术：

1896年vahermengen首次分离出肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)，并证实它能在厌氧环境中生长，且可产生外毒素-肉毒毒素(botulinumtoxin),肉毒梭菌具体特征为革兰氏染色阳性菌、厌氧、短粗杆菌，其生长繁殖及产毒的最适宜温度为18～30℃,1910年，人们根据肉毒梭菌及其毒素抗原性的不同,将其分为a、b、c、d、e、f和g七个型，其中a、b、e、f为人中毒型别，c、d型为动物和家禽的中毒型别。

肉毒毒素中毒是神经型中毒，人服0.1μg即可致命，纯化的肉毒毒素1mg能杀死2亿只小鼠，其中毒发病机理为：肉毒毒素可抑制神经传导介质—乙酰胆碱的释放导致肌肉麻痹，重症者亦可影响颅神经,其症状主要是神经系统症状，以对称性颅神经损害的症状为特征，如视力模糊、眼睑下垂、复视、瞳孔散大、语言障碍、吞咽困难、呼吸困难，继续发展可由于呼吸肌麻痹引起呼吸功能衰竭而死亡,肉毒梭菌食物中毒是细菌性食物中毒中最严重的一种。

肉毒梭菌广泛分布于土壤、淤泥及动物粪便中，其中土壤是重要污染源，它可借助食品、农作物、水果、海产品、昆虫、禽类等传播到各处。食品在加工、贮藏过程中被肉毒梭菌污染，并产生毒素，食前对带有毒素的食品又未加热或未充分加热，因而引起中毒。在我国发生的肉毒毒素中毒与部分地区的饮食习惯有很大关系，主要是食用保存不当的肉制品和豆谷类发酵食品。

现在肉毒梭菌菌体的检测方法主要是聚合酶链式反应(pcr)，但传统的pcr检测不能区分活菌和死菌，不利于对致病菌的预防控制以及风险评估，另外实验需要热循环，结果也要有其他检测步骤,操作比较复杂。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的不利于对致病菌的预防控制、操作不便的缺陷，而提供一种可视化检测食品中肉毒梭菌活菌的方法。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种可视化检测食品中肉毒梭菌活菌的方法，具体步骤如下：

(1)、根据肉毒梭菌的ha-70基因上一段高度保守的序列，设计lamp引物，包括一对内引物fip/bip和一对外引物f3/b3；

(2)、将1ml待测样本加入pma，使pma的浓度为20-30μm，然后置于冰上暗处静置6-10min，接着用650w卤灯在15-20厘米处，照射5min；

(3)、将处理后的样本提取dna，然后以提取物作为模板，进行lamp扩增；

(4)、如果有白色浑浊沉淀，说明样本中有肉毒梭菌活菌。

作为优选，所述的步骤(1)中，利用primerexplorerversion4.0在线软件设计lamp引物。

作为优选，所述的步骤(1)中，所述的内引物fip的具体序列为

ctgagaaacaccaccagaccattatcgtatattcttgagagaaaagtgta，

所述的内引物bip的具体序列为tgctaccagatgtatttgtctcaatggcgatggatatatgagaacaa，

所述的外引物f3的具体序列为gcatcgttaagtcttgcttc，

所述的外引物b3的具体序列为caatacttccttatcctaatggatt。

作为优选，所述的步骤(3)中，样本提取dna的方法为：

将样本加入1ml细胞裂解液和100mg/ml蛋白酶k,56℃水浴2个小时，每隔半个小时摇匀一次，加入700μl混合液，其中混合液中酚：氯仿：异戊醇为25：24：1，12000rpm条件下，离心15min，取上清，然后向上清内加入0.1倍上清体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-20℃的条件下，静置2个小时，出现沉淀后，12000rpm条件下，离心10min，弃上清，加70％乙醇，混匀，7500rpm条件下，5min，再弃上清，静置，风干后，加洗脱液溶解。

作为优选，所述的步骤(3)中，lamp反应体系为50μl：bst链置换聚合酶8u(2μl)、模板(4μl)、10×thermopol(5μl)、mgso410mm(3μl)、dntps1.5mm(7μl)、f3/b3(2μl/2μl)、fip/bip(2μl/2μl)、mlv酶10u(2μl)，最后用depc水补至50μl。

作为优选，所述的步骤(3)中，lamp扩增反应的反应条件为：水浴或pcr仪65℃孵育1h，接着bst链置换聚合酶80℃热失活5min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：

本发明的主要原理为：针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，30-60分钟左右即可实现109～1010拷贝的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点，在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色，因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察，本发明同时使用荧光染料pma(propidiummonoazide)，pma是一种dna高亲和力的光反应染料，染料能嵌入死细胞双链d8na，如果暴露在强烈的可见光下可形成共价连接，形成化学修饰dna，使dna不能发生扩增反应，从而抑制lamp扩增，可以有效区分死细菌和活细菌。

综上所述，本发明所述的可视化检测肉毒梭菌活菌的方法，操作简单，灵敏度高，为食品中检测致病菌提供有力的技术支持。

附图说明

图1为实施例1中的实验结果图；

图2为lamp扩增产物的电泳检测结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种可视化检测食品中肉毒梭菌活菌的方法，具体步骤如下：

(1)、根据肉毒梭菌的ha-70基因上一段高度保守的序列，设计lamp引物，包括一对内引物fip/bip和一对外引物f3/b3；

(2)、将1ml待测样本加入pma，使pma的浓度为20-30μm，然后置于冰上暗处静置6-10min，接着用650w卤灯在15-20厘米处，照射5min；

(3)、将处理后的样本提取dna，然后以提取物作为模板，进行lamp扩增；

(4)、如果有白色浑浊沉淀，说明样本中有肉毒梭菌活菌。

作为优选，所述的步骤(1)中，利用primerexplorerversion4.0在线软件设计lamp引物。

作为优选，所述的步骤(1)中，所述的内引物fip的具体序列为

ctgagaaacaccaccagaccattatcgtatattcttgagagaaaagtgta，

所述的内引物bip的具体序列为tgctaccagatgtatttgtctcaatggcgatggatatatgagaacaa，

所述的外引物f3的具体序列为gcatcgttaagtcttgcttc，

所述的外引物b3的具体序列为caatacttccttatcctaatggatt。

作为优选，所述的步骤(3)中，样本提取dna的方法为：

将样本加入1ml细胞裂解液和100mg/ml蛋白酶k,56℃水浴2个小时，每隔半个小时摇匀一次，加入700μl混合液，其中混合液中酚：氯仿：异戊醇为25：24：1，12000rpm条件下，离心15min，取上清，然后向上清内加入0.1倍上清体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-20℃的条件下，静置2个小时，出现沉淀后，12000rpm条件下，离心10min，弃上清，加70％乙醇，混匀，7500rpm条件下，5min，再弃上清，静置，风干后，加洗脱液溶解。

作为优选，所述的步骤(3)中，lamp反应体系为50μl：bst链置换聚合酶8u(2μl)、模板(4μl)、10×thermopol(5μl)、mgso410mm(3μl)、dntps1.5mm(7μl)、f3/b3(2μl/2μl)、fip/bip(2μl/2μl)、mlv酶10u(2μl)，最后用depc水补至50μl。

作为优选，所述的步骤(3)中，lamp扩增反应的反应条件为：水浴或pcr仪65℃孵育1h，接着bst链置换聚合酶80℃热失活5min。

本发明提供一种快速检测食品中肉毒梭菌活菌的方法，不仅解决现有pcr法不能有效区分肉毒梭菌活菌和死菌的问题，而且实验过程不需要其他特殊的仪器，结果可根据扩增反应直接判断。由于本发明针对靶序列的6个区域设计的4种特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此实验结果的准确性比传统的pcr法更高。

实施例1

(1)、根据肉毒梭菌的ha-70基因(genbank登录号：ab037166.1)上一段高度保守的序列，利用primerexplorerversion4.0在线软件设计lamp引物，包括一对内引物fip/bip和一对外引物f3/b3，所述的内引物fip的具体序列为

ctgagaaacaccaccagaccattatcgtatattcttgagagaaaagtgta，

所述的内引物bip的具体序列为tgctaccagatgtatttgtctcaatggcgatggatatatgagaacaa，

所述的外引物f3的具体序列为gcatcgttaagtcttgcttc，

所述的外引物b3的具体序列为caatacttccttatcctaatggatt；

(2)、将1ml待测样本加入pma，使pma的浓度为25μm，然后置于冰上暗处静置6-10min，接着用650w卤灯在16厘米处，照射7min；

(3)、将处理后的样本做dna提取，然后以提取物作为模板，进行lamp扩增；

将样本加入1ml细胞裂解液和100mg/ml蛋白酶k,56℃水浴2个小时，每隔半个小时摇匀一次，加入700μl混合液，其中混合液中酚：氯仿：异戊醇为25：24：1，12000rpm条件下，离心15min，取上清，然后向上清内加入0.1倍上清体积的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，在-20℃的条件下，静置2个小时，出现沉淀后，12000rpm条件下，离心10min，弃上清，加70％乙醇，混匀，7500rpm条件下，5min，再弃上清，静置，风干后，加洗脱液溶解；

lamp反应体系为50μl：bst链置换聚合酶8u(2μl)、模板(4μl)、10×thermopol(5μl)、mgso410mm(3μl)、dntps1.5mm(7μl)、f3/b3(2μl/2μl)、fip/bip(2μl/2μl)、mlv酶10u(2μl)，最后用depc水补至50μl；

lamp扩增反应的反应条件为：水浴或pcr仪65℃孵育1h，接着bst链置换聚合酶80℃热失活5min；

(4)、结果判断：如果有白色浑浊沉淀，说明样本中有肉毒梭菌活菌，实验结果如图1所示，1号管为阴性对照(模板为纯化水)；2号管为未经pma处理的活细菌；3号管为经pma处理的死菌液；4号管为经pma处理的活菌液；其中3号管未发生lamp反应，说明pma可以抑制死菌的lamp扩增；

(5)、lamp扩增产物的电泳检测

将上述1-4号管分别取5μllamp扩增产物，与loadingbuffer混匀，点样于质量浓度为2％的琼脂糖凝胶中，以100v电压在1×tae电泳缓冲液中电泳30min，然后在凝胶成像系统中成像，即完成检测。

结果如图2所示，m为dnamarker,泳道1为阴性对照(模板为纯化水)，泳道2为未经pma处理的活细菌；泳道3为经pma处理的死菌液；泳道4为经pma处理的活菌液；结果显示有肉毒梭菌活菌的泳道2和泳道4均有条带，实验结果与步骤4一致。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。