源于血红蛋白的免疫活性人胎盘多肽的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及具有免疫活性功能的源于血红蛋白的活性多肽，包含活性多肽的组合物或制剂以及活性多肽、含有活性多肽的组合物或制剂在制备用于治疗免疫疾病、癌症和/或乙型肝炎等疾病的药物中的应用。

背景技术：

胎盘(placenta)是哺乳动物妊娠期间由胚胎的胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间交换物质的过渡性器官。胎盘由羊膜(amnioticmembrane)、叶状绒毛膜(chorionfrondosum)和底蜕膜构成。

人胎盘的成分较复杂。还含有干扰素(interferon)，有抑制多种病毒对人细胞的作用，含有巨球蛋白称β抑制因子(β-inhibitor)能抑制流感病毒。胎盘中含有与血液凝固有关的成分，有类似凝血因子ⅻ的纤维蛋白稳定因子；尿激酶抑制和纤维蛋白溶酶原活化物。通常情况下纤维蛋白深酶原活化物的作用远低于抑制物。人胎盘中还含有许多激素及促肾上腺皮质激素。人胎盘中还含有多种有应用价值的酶。此外，尚含有红细胞生成素，磷脂(phospholipid)，β-内啡肽(β-endorphin)，氨基多糖体(系由8分子乙酰氨葡萄糖、6分子甘露糖所组成)。胎盘乳原(多肽化合物)含多种氨基酸，并含微量维生素b12，乙酰胆碱及碘等。

已经对胎盘成分进行了研究和利用，如彭立义等报道了胎盘免疫调节肽及其应用。胎盘免疫调节肽是一种可透析、可超滤的多肽,含有16种氨基酸，分子量为6000以下。胎盘免疫调节肽对balb/c小鼠具有促进生长、发育的功能；可使95.2％的pha皮试阴性者转阳；使因温育37℃而降低的玫瑰花结形成率恢复至活性花结水平；同时经164例临床应用研究证明,胎盘免疫调节肽可不同程度地提高患者的细胞免疫功能。(彭立义等：胎盘免疫调节肽的鉴定与临床应用；新药与临床：1990年03期)。

韩国延世大学的hyoung-joolee等人利用正常人和先兆性子痫病人的胎盘组织作为研究对象，用蛋白组学的分析方法，对人胎盘组织中的蛋白质和多肽做了分析，结果鉴定了人胎盘组织中的4239种独特蛋白质，219种独特的n-末端链接的糖肽，592种独特的磷酸肽(phosphopeptides)，66种13号染色体特异的蛋白质。其中，28种蛋白质显示为差异表达的先兆性子痫特异性蛋白质。(leehjetal:comprehensivegenome-wideproteomicanalysisofhumanplacentaltissueforthechromosome-centrichumanproteomeproject.jproteomeres.2013feb14)。但这些特异性蛋白质和多肽的生物学效用还有待进一步研究。

济南军区肝病研究所张光曙教授所领导和主持的研究小组，通过三十年的临床研究发现利用乙肝病毒表面抗原阴性、乙肝病毒表面抗原抗体阳性的人胎盘作为转移因子和核糖核酸制备的材料，制备分子量在8000以下的胎盘转移因子，发现该转移因子来治疗慢性乙型肝炎，以及与乙肝病毒感染相关的肝硬化和肝癌获得相当好的临床疗效。同时，用于丙型肝炎(115例)也有治疗效果，对癌症病人免疫系统的增强作用十分明显。

目前对于转移因子的研究主要集中于含有特异免疫活性的乙肝人体胎盘转移因子的胎盘提取物的制备及其治疗效果。例如，cn1579536a公开了一种抗乙肝胎盘转移因子注射液的制备方法；cn1299763c公开了一种抗乙肝人体胎盘转移因子粉针剂的制备方法；cn1554363a公开了一种具有特异免疫活性的抗乙肝胎盘特异因子提取物及其制备工艺。但是这些专利都没有对于其中的活性成分及其作用进行研究。

血红蛋白的主要功能是在血液中结合并转运氧，但血红蛋白的功能不仅仅是运输氧。achally等于1971年的研究报道了血红蛋白的酶消化产物具有生长激素释放活性(andrewv.schally等，j.bio.chem.，1971；246:6647-6650)，之后的研究表明血红蛋白生物活性肽具有多种重要的功能活性，如阿片样活性(brantlv等，eurjpharmacol1986；125:309-10；lignotb等，biotechnolapplbiochem1999，30:201-7)、抗氧化活性(cn101298470a)、增强血管舒缓激肽活性(piotjm等，febslett1992，299：75-79)、抗菌活性(fogacaac等，j.bio.chem.，1999；274:2530-2534；parishca等人，bioorg.med.chem.2001，9：377)等。此外，liepkec等人的研究发现，从人胎盘肽库纯化的血红蛋白来源的肽显示出抗菌活性，首次证明了天然加工的人血红蛋白片段的抗菌活性(cornelialiepke等，j.bio.chem.，2003；791:345-356)；sahad等人的实验则表明nf-kb在血红蛋白α亚基启动子中发挥作用，指示血红蛋白α和血红蛋白β亚基可以充当炎症和感染的内源性抗菌防御蛋白质(sahad等，plosone，2017；12(2)：e0171084)。但这些研究均没有公开血红蛋白活性肽的免疫刺激活性及其在疾病治疗中的用途。

而国内对血红蛋白肽的研究则集中于不同哺乳动物血红蛋白肽组合物及其制备，如cn101366943a、cn101744092a、cn101194665a、cn1004395c、cn101298470a、cn103230587a等。

目前尚未发现有关血红蛋白免疫活性肽的免疫刺激活性和用途的报道。

本发明利用蛋白组学的方法研究抗乙肝转移因子，从其中的主要成分分离获得(血红蛋白)多肽片段，并进行氨基酸序列分析、多肽合成，免疫性实验研究。发现这些血红蛋白多肽片段对病人体内非特异性和特异性免疫具有调节作用，可以用作免疫调节剂，是治疗或辅助治疗免疫疾病、哮喘、肝炎例如乙型肝炎、癌症、或其他相关的疾病的活性成分组成部分。

技术实现要素：

公开内容

本发明的目标是提供具有免疫活性的源于血红蛋白的多肽。

本发明的另一目标为提供利用蛋白组学的方法从抗乙肝转移因子中分离(血红蛋白)多肽片段的方法。

本发明的另一目标为提供通过该方法鉴定的源于血红蛋白的活性多肽。

本发明的又一目标为提供源于血红蛋白的活性多肽的应用。

技术方案

本发明涉及利用蛋白组学的方法对从乙肝转移因子中分离得到的有效多肽(活性多肽)的分析和发现，对乙肝转移因子中的多肽进行氨基酸序列分析。发现这些活性多肽对病人体内非特异性和特异性免疫具有调节作用，可以用作免疫调节剂，可用于治疗或辅助治疗免疫疾病、肝炎例如乙型肝炎、癌症疾病、哮喘或其他相关的疾病。

在用于实现上述目标的一个方面，本发明提供利用蛋白组学的方法从抗乙肝转移因子中分离的源于血红蛋白的活性多肽。

根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽的特征在于，其对病人体内非特异性和特异性免疫具有调节作用，可以用作免疫调节剂。具体地，源于血红蛋白的活性多肽都具有免疫活性，可以促进单个核细胞例如巨噬细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能。

根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽衍生自人血红蛋白α、β链，具有免疫调节作用，例如激活免疫细胞的功能。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽包括选自如下氨基酸序列：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽是选自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一个实施方式中，所述免疫细胞包括单个核细胞。

在一个实施方式中，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

在一个实施方式中，单个核细胞包括巨噬细胞。

在一个实施方式中，激活免疫细胞的功能包括促进单个核细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能。

在用于实现上述目标的另一方面，本发明提供组合物，其包括根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽。

在一个实施方式中，根据本发明的组合物还进一步包括药学上可接受的载体。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽包括选自如下的氨基酸序列：

与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列；

与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列；

与seqidno:3的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列；

与seqidno:4的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列；

与seqidno:5的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽包括选自如下氨基酸序列：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽是选自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一个实施方式中，根据本发明的组合物进一步药学上可接受的载体。

在用于实现上述目标的又一方面，本发明提供制剂，所述制剂通过如下方法制备，所述方法包括：

1)将新鲜胎盘直接放入无菌0～4℃的保温容器中，之后将胎盘装入真空包装内并在低温(低于-18℃)的条件下保存，例如，在液氮中或在-70℃下保存，优选地，在-22℃至-18℃下保存；

2)将以上保存的胎盘20～30℃解冻，加入0.05-0.5％氯化钠水溶液并均质以获得匀浆；

3)将以上获得的匀浆于0～10℃恒温条件下进行有效成分浸提0.5-5小时，再将匀浆升温至55℃～65℃，连续均匀水浴5～15小时，完成病毒灭活，然后将匀浆冷却至10℃以下；

4)将以上获得的匀浆在温度为4℃～10℃、转速为3000～12000r/min的条件下离心30～100分钟，获得上清液；和

5)将以上获得的上清液进行超滤处理，获得所述含有抗乙肝胎盘转移因子的生物制剂。

在一个实施方式中，制备根据本发明的制剂的方法还包括：

6)将获得的提取物用生理盐水或注射用水调配，然后经过0.22μm孔径的滤芯/滤膜除菌，获得注射液半成品，和任选地：

7)将以上获得的注射液半成品配制成注射液或制成冻干粉针剂。

在一个实施方式中，所述胎盘是人胎盘，优选乙型肝炎病毒表面抗体(hbsab)阳性，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原体均为阴性的人胎盘。

在进一步的实施方式中，在上述步骤5)中的超滤处理是如下进行：将上清液经截留分子量为80～200kd的中空超滤纤维柱超滤，所得滤液再用截留分子量为5～20kd(优选10kd)的中空超滤纤维柱超滤，收集滤液。

在一个实施方式中，滤液包括分子量小于10kd的物质，例如，包括但不限于核酸、多肽等。

在一个实施方式中，胎盘装入真空包装内并且优选地在约-20℃的条件下保存。

在一个实施方式中，氯化钠水溶液的浓度优选为约0.1％。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂为注射液或冻干粉针剂形式。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂其包括根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂含有一种或多种选自以下的多肽：与seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

与seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

与seqidno:3的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

与seqidno:4的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

与seqidno:5的氨基酸序列具有至少80％同一性，更优选地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最优选地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂含有一种或多种选自以下的多肽：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽是选自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂含有本发明的源于血红蛋白的活性多肽和药学上可接受的载体。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂还含有另外的制剂，例如增强免疫的药物。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂还含有另外的制剂，例如用于治疗乙型肝炎的药物，如拉米夫定。

在一个实施方式中，根据本发明的制剂还含有另外的制剂，例如用于治疗癌症的药物。

在一个实施方式中，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽包括选自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用作免疫调节剂。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用于制备促进单个核细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的组合物可以用于制备促进单个核细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的制剂可以用于制备促进单个核细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用于制备治疗或辅助治疗炎症或感染的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的组合物可以用于制备治疗或辅助治疗炎症或感染的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的制剂可以用于制备治疗或辅助治疗炎症或感染的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用于制备治疗或辅助免疫疾病的疾病的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的组合物可以用于制备治疗或辅助免疫疾病的疾病的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的制剂可以用于制备治疗或辅助免疫疾病的疾病的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用于制备治疗或辅助治疗癌症的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的组合物可以用于制备治疗或辅助治疗癌症的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的制剂可以用于制备治疗或辅助治疗癌症的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽可以用于制备治疗或辅助治疗乙型肝炎的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的组合物可以用于制备治疗或辅助治疗乙型肝炎的药物。

在实现上述目标的又一方面，根据本发明的制剂可以用于制备治疗或辅助治疗乙型肝炎的药物。

在一个实施方式中，免疫疾病的疾病包括免疫力低下的状况，例如包括但不限于，癌症、哮喘。

有益效果

根据本发明的源于血红蛋白的活性多肽在单个核细胞产生促炎因子和提高巨噬细胞的抗原递呈功能方面效果显著。具体地，源于血红蛋白的活性多肽能够显著刺激单个核细胞(例如，巨噬细胞)中il-2、il-6、il-17、hlaii的表达，表明本发明的源于血红蛋白的活性多肽能提高巨噬细胞的抗原提呈功能，并促进单个核细胞产生促炎因子。

附图说明

图1显示根据本发明的方法获得的生物制剂中免疫活性多肽的指纹图谱(lcms/ms)，其中的2个主峰包括本发明的活性多肽α1、α2、β1、β2和β3；

图2-1至图2-6显示根据本发明的方法获得的生物制剂中免疫活性多肽的指纹图谱(lcms/ms)，其中图2-1标出的5个峰显示本发明的活性多肽α1、α2、β1、β2和β3，并且图2-2至图2-6分别具体显示了多肽α1、α2、β1、β2和β3各自的质谱图；

图3显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独作用于pbmc细胞48h后il-10的表达量，其中，与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著；

图4显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2肽单独作用于pbmc细胞48h后il-2的表达量；

图5显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独作用于pbmc细胞48h后il-6的表达量，其中，与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图6显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独作用于pbmc细胞48h后tnf-α的表达量

图7为显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独作用于pbmc细胞48h后il-1β的表达量，其中与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图8显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-10的表达量；

图9显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-2的表达量；

图10显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2肽单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后tnf-α的表达量；

图11显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-6的表达量，其中，与pha组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图12显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-1β的表达量，其中，与pha组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图13显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-4的表达量；

图14显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独与pha同时作用于pbmc细胞48h后il-17a的表达量，其中，与pha组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图15显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2作用48h，cd4、cd8表达水平；

图16显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2作用72h，cd4、cd8表达水平；

图17显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独或作用于thp-1细胞48h后cd86的表达量；

图18显示本发明的源于血红蛋白的活性多肽α1、α2单独或作用于thp-1细胞48h后hlaii的表达量，其中，与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图19显示三种肽单独作用于外周血单个核细胞il-17a的表达水平，其中与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图20显示三种肽单独作用于外周血单个核细胞ifn-γ的表达水平；

图21显示三种肽单独作用于外周血单个核细胞tnf-α的表达水平；

图22显示三种肽单独作用于外周血单个核细胞il-2的表达水平；

图23显示三种肽单独作用于外周血单个核细胞il-6的表达水平；

图24显示.三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞il-17a的表达水平，其中，与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图25显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞il-6的表达水平，其中，与对照组比较，*表示“p<0.05，差异显著”，**表示“p<0.01，差异极显著”；

图26显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞il-2的表达水平；

图27显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞ifn-γ的表达水平；

图28显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞il-10的表达水平；

图29显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞il-4的表达水平；

图30显示三种肽与pha共同作用于外周血单个核细胞tnf-α的表达水平；

图31显示三种肽单独作用于单个核细胞后，cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞的百分含量；

图32显示三种肽与pha共同作用于单个核细胞后，cd4⁺t细胞和cd8⁺t细胞的百分含量；

图33显示thp-1细胞经三种肽刺激后il-1β的表达水平；

图34显示thp-1细胞经三种肽刺激后tnf-α的表达水平；

图35显示thp-1细胞表面cd86的表达水平；

图36显示thp-1细胞表面hlaii类分子的表达水平。

具体实施方式

实施例

下文中，本发明将参考实施例来更详细描述。以下实施例是对发明的进一步说明，对于本发明所属技术领域的技术人员显而易见的是，这些实施例和说明仅用于说明性目的，并不构成对本发明实质内容的限制。

在没有进一步详细说明的情况下，本文引述的全部公开物通过引用将它们的全部结合在此。

下列实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为商业可得。

一、人胎盘材料的获得：

产妇体检标准：病人血清学检测，乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)抗体检查阳性；乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原体均为阴性结果的病人。

人胎盘组织的检测标准：人胎盘组织检测，乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)抗体检查阳性；乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原体均为阴性结果的胎盘材料。

凡患有恶性肿瘤、免疫缺陷病、急性传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿及肉眼检查外观不正常、保存运输不当而变质者均不得使用。

人胎盘材料的获取、运输和储存：将新鲜人胎盘从无菌的接生或手术领域，直接放入无菌低温(0℃-4℃)的保温容器中，在低温的条件下运输至gmp车间或glp实验室；在无菌条件下，将胎盘的附属结构去除，即除筋膜、脐带、胎盘组织的母体面等；留下胎盘组织，用注射用水冲洗、沥干、剪碎、称重，置无菌容器内，专门的储存低温冰箱中(-20℃)。

1、乙肝转移因子的制备

(1)人胎盘材料的预处理

产妇体检标准：病人血清学检测，乙型肝炎病毒表面抗体(hbsab)阳性；乙型肝炎病毒hbsag，hbeag，hbeab，hbcab、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原体(梅毒、淋病等)均为阴性结果的病人。

选用乙型肝炎病毒表面抗体(hbsab)阳性，乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原体均为阴性的胎盘。且患有恶性肿瘤、免疫缺陷病、急性传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿及肉眼检查外观不正常、保存运输不当而变质者均不得使用。

凡患有恶性肿瘤、免疫缺陷病、急性传染病、人工流产、死胎、各种畸形儿及肉眼检查外观不正常、保存运输不当而变质者均不得使用。

将新鲜人胎盘从无菌手术室获得后，直接放入无菌低温(0℃-4℃)的保温容器中，并在低温的条件下存储和运输。

在无菌条件下，去除胎盘附属结构(脐带、羊膜)所得胎盘组织用注射用水冲洗、沥干，切成小块(约1cm²)，置无菌容器内，低温(-20℃)存储。

(2)匀浆调配

取上述冷冻的胎盘组织块，于20-30℃条件下复温，随后加入含有0.1mol/l(约0.6％)的氯化钠的注射用水，胎盘：盐水(w/w)＝1：(2～4)。在温度为4～10℃的条件下，将混合物在胶体磨中均质10～15min。在高倍显微镜(1000倍)下观察，观察不到完整的细胞。

(3)有效成分的提取和病毒的灭活处理

将上述匀浆于10℃恒温条件下，浸提有效成分1h。

之后再将匀浆置于55℃～65℃，连续均匀水浴10小时，完成病毒灭活。灭活后的匀浆冷却至10℃以下。

(4)离心处理

将匀浆转移至离心容器中，在温度为4℃～10℃、转速为3000-12000rpm的条件下离心30～100分钟，收集并调节上清液ph在6.5～7.5之间。

(5)超滤处理

将上清液经80～200kd的中空超滤纤维柱超滤，滤液再用5～20kd的中空超滤纤维柱超滤，收集滤液，该滤液即抗乙肝转移因子原液。

(6)除菌处理

将所得原液用生理盐水或注射用水稀释调配后(多肽>0.5mg/ml)，经过0.22μm的除菌滤芯过滤，获得抗乙肝转移因子半成品。

(7)注射剂的制备

将半成品用2倍生理盐水稀释，使溶液中多肽的含量达到0.5mg/ml，进一步分装得液体针剂或粉针剂。

二、抗乙肝转移因子中源于血红蛋白的活性多肽的获得和分析

样品经过上述多肽分离提取之后，制剂成为注射液或粉针剂，样品分析按照lcms/ms常规的氨基酸分析技术，由美国prottech公司(prottech，inc.)实施。nanollcms/ms技术参考jwu,xluo,ljyan的文献：twodimensionalbluenative/sds-pagetoidentifymitochondrialcomplexisubunitsmodifiedby4-hydroxynonenal(hne).frontiersinphysiology,2015。高效液相色谱柱用75mm内径的反相c18柱；数据分析采用prottech公司的数据分析方法。按照样品经过分离获得的指纹图谱，将含量最高的主要峰段进行氨基酸序列分析，获得2个主峰的氨基酸序列(图1)。进一步对多肽的来源进行分析，发现这些多肽来源于血红蛋白。确定本发明中的5个多肽的氨基酸序列，再经过对质谱中的多肽序列与人血红蛋白序列比对，结果显示其中的2个多肽来源于人血红蛋白α亚基，另外3个多肽来源于人血红蛋白β亚基。具体的序列比对结果如下。

与人血红蛋白α亚基氨基酸序列的比对:

mvlspadktnvkaawgkvgahageygaealermflsfpttktyfphfdlshgsaqvkghgkkvadaltnavahvddmpnalsalsdlhahklrvdpvnfkllshcllvtlaahlpaeftpavhasldkflasvstvltskyr(seqidno:7)；

与人血红蛋白β亚基氨基酸序列的比对：

mvhltpeeksavtalwgkvnvdevggealgrllvvypwtqrffesfgdlstpdavmgnpkvkahgkkvlgafsdglahldnlkgtfatlselhcdklhvdpenfrllgnvlvcvlahhfgkeftppvqaayqkvvagvanalahkyh(seqidno:8)。

如下面详细描述的，经过对这些多肽的活性进行研究，证实了这些多肽对人外周血细胞具有免疫刺激活性。

三、血红蛋白活性多肽的合成

1、实验组多肽设计

1.1血红蛋白α亚基多肽的合成，从基因库中获取血红蛋白α亚基的全氨基酸序列。见sp|p69905|hba_humanhemoglobinsubunitalphaos＝homosapiensgn＝hba1pe＝1sv＝2。序列为：

mvlspadktnvkaawgkvgahageygaealermflsfpttktyfphfdlshgsaqvkghgkkvadaltnavahvddmpnalsalsdlhahklrvdpvnfkllshcllvtlaahlpaeftpavhasldkflasvstvltskyr(seqidno:7)。根据上述比对结果，获得以下两段多肽。

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

1.2血红蛋白beta亚基多肽的合成，从基因库中获取血红蛋白beta亚基的全氨基酸序列。见sp|p68871|hbb_humanhemoglobinsubunitbetaos＝homosapiensgn＝hbbpe＝1sv＝2。序列为：

mvhltpeeksavtalwgkvnvdevggealgrllvvypwtqrffesfgdlstpdavmgnpkvkahgkkvlgafsdglahldnlkgtfatlselhcdklhvdpenfrllgnvlvcvlahhfgkeftppvqaayqkvvagvanalahkyh(seqidno:8)。根据上述比对结果，获得以下三段多肽。

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)

2、对照组

胸腺是t细胞发育分化、成熟的场所，胸腺多肽是胸腺微环境中的重要成分，在t细胞的发育分化中发挥调节作用。

胸腺五肽:rkdvy(5aa)(seqidno:6)

3、多肽合成

多肽合成采用fmoc固相合成法，使用csbio公司的cs336多肽合成仪，由c端到n端逐步依次将氨基酸连接而成。

四、对合成的活性多肽的免疫学检测

1、材料与方法

单个核细胞(pbmc)来源于健康献血者外周血。正常人肝素抗凝血经聚蔗糖-泛影葡胺分离液(比重1.077)密度梯度离心(参见《免疫学检验》，2006年8月第一版)后，取单个核细胞层，洗涤后用rpmi-1640完全培养基(购自bbi公司)(含10％胎牛血清(购自themofisher公司)，100u/ml青霉素、链霉素)重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，于37℃5％二氧化碳恒温孵箱中培养。

巨噬细胞株thp-1(人单核细胞白血病细胞系)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。thp-1细胞培养于rpmi-1640完全培养基中，于37℃5％二氧化碳恒温孵箱中培养传代。

α1、α2、β1、β2、β3分别代表人工合成的多肽；t5代表胸腺5肽。

2.多肽对细胞的作用：

分离的pbmc细胞以1×10⁶个/ml浓度接种于24孔板，分别以5、10、20、40mg/ml的浓度将待测肽加入各孔，其中一组培养48小时后收集细胞和上清。另一组在加入肽6小时后，再每孔加入pha3μg/ml,共培养48h后收集细胞和上清。实验重复2次，每次双复孔。

将扩增好的thp-1细胞以1×10⁶个/ml浓度接种于12孔板，分别以5、10、20、40mg/ml的终浓度将待测肽加入各孔中，培养24小时后收集细胞和上清，实验重复3次，每次双复孔。

3.检测

收集的单个核细胞在不同的管中，分别加入抗cd3-apc、cd4-fitc和cd8-pe标记抗体，每种抗体20μl，室温避光孵育30min，离心洗涤后加入500μlpbs，悬起细胞，避光保存；thp-1细胞加入hla-dr-apc和cd86-pe标记抗体，室温避光孵育30min，离心洗涤后加入500μlpbs，悬起细胞，避光保存；用流式细胞仪进行检测。

收集上清，按照cba试剂盒说明书操作，流式细胞仪检测il-2、il-6、il-4、il-10、tnf-α、il-17a和il-1β细胞因子蛋白表达水平。

4.统计学方法

数据结果以均数±标准差(x±s)表示，采用spss16.0统计软件进行统计学处理。各种细胞因子在经肽刺激后的表达量的测量数据与对照组间的比较采用重复测量数据的单因素方差分析。p<0.05认为差异具有统计学意义。

五.多肽α1、α2免疫活性检测结果及结果分析

将α1和α2两种肽作用于人巨噬细胞株thp-1和外周血单个核细胞，用流式技术检测这些细胞表面分子和细胞因子的表达水平，评价两种多肽的调节作用。结果显示，α1在40、80μg/ml的浓度时显著刺激巨噬细胞hla-dr分子的表达，α2在各浓度均刺激hla-dr分子的表达，以80μg/ml最为显著。α1和α2单独刺激单个核细胞48小时后，炎症因子il-6、il-1β、tnf-α和il-10表达均增加，尤以α1在10μg/ml浓度时最为显著。α1和α2与pha共同刺激外周血单个核细胞，在48小时显著促进il-6、il-4和il-17a和il-1β表达。结果表明两种肽能提高巨噬细胞的抗原提呈功能，并促进单个核细胞产生促炎因子。提示两种肽对免疫细胞具有一定的调节作用，对临床免疫治疗药物的开发具有重要意义，但机制还有待于进一步研究。

两种多肽α1、α2和对照t5作用于外周血单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞等细胞之后的细胞因子的表达变化

1.两种肽单独作用于单个核细胞产生的细胞因子结果：

如图3所示，两种肽单独刺激单个核细胞在48小时内促进il-10表达，α1在5μg/ml、10μg/ml浓度时较为显著，分别达到7.24±1.35pg/ml、84.17±38.92pg/ml。两种肽单独刺激外周血单个核细胞72h后il-10未检测出；48和72小时后il-4、ifn-γ和il-17a均未检测出。

如图4所示，两种肽单独刺激单个核细胞在48小时后il-2产生量比对照均有减少。

如图5所示，两种肽单独刺激单个核细胞在48小时后il-6产生量明显增加，α1在5μg/ml、10μg/ml浓度时最为显著，分别达到2719±52.76pg/ml、15307±108.42pg/ml；α2在5μg/ml浓度时最为显著，达到2719±112.23pg/ml；t5在5μg/ml浓度时最为显著，达到3460±238.46pg/ml。

如图6所示，两种肽α1、α2单独刺激单个核细胞在48小时后il-1β产生量较对照均有增加，α1在10μg/ml浓度时比对照明显增加最多，最为显著；α1在5μg/ml时次之，产生量为70.86±19.68pg/ml。

如图7所示，两种肽α1、α2单独刺激单个核细胞在48小时后il-1β产生量明显增加，α1在10μg/ml浓度时最为显著，达到338.46±102.65pg/ml。

2.两种肽α1、α2与pha同时作用于外周血单个核细胞后产生的细胞因子特点：

两种肽α1、α2与pha同时作用于单个核细胞48和72小时后，72h后除il-4、ifn-γ和il-17a未检测出外，其余细胞因子均产生。

两种肽α1、α2与pha同时作用于单个核细胞48和72小时后，与对照组相比il-2、il-10、tnf-α的产生均无显著差异，见图8-10。

如图11所示，两种肽α1、α2与pha共同刺激单个核细胞在48小时后il-6产生量较pha对照组433±32.61pg/ml明显增加,差异显著。

如图12所示，两种肽α1、α2单独刺激单个核细胞在48小时后il-1β较pha组的515.81±59.68pg/ml产生量明显增加，α1在40μg/ml浓度时显著，达到1087.04±97.56pg/ml；α2在各浓度时均显著，分别达到1081±65.39、1014±105.3、1036±115.8、981±134.76pg/ml；t5在10μg/ml浓度时显著，达到1199.81±358.47pg/ml；肽在20μg/ml浓度时未检测出。

两种肽α1、α2与pha同时作用于单个核细胞48小时后，与对照组相比il-4的产生量略有增加，但均无显著差异，见图13。

如图14所示，两种肽α1、α2单独刺激单个核细胞在48小时后il-1β较pha组的0pg/ml产生量明显增加，α1在各浓度时均显著；α2在各浓度时均显著；t5在20μg/ml浓度时显著，达到1199.81±358.47pg/ml。

3.两种肽α1、α2单独或与pha共同作用于外周血单个核细胞cd4、cd8细胞的表达水平：

用流式技术仪检测经两种肽作用的单个核细胞cd3+t细胞中cd4+t和cd8+t细胞的百分含量。与空白对照组相比，无显著差异，如图15-16所示。说明两种肽对单个核细胞中两个细胞亚群的总量和分化无显著影响，即它们在体外不能促进cd4和cd8细胞亚群的分化。

4两种肽α1、α2作用于thp-1细胞的结果

4.1.thp-1细胞经两种肽α1、α2刺激24小时和48小时后细胞因子的表达：

thp-1细胞经两种肽α1、α2刺激24和48小时后，收集上清，cba法检测上清中il-1β和tnf-α的表达，检测结果均为0，说明两种肽α1、α2均不能刺激thp-1细胞产生该两种细胞因子。

4.2.thp-1细胞表面分子的表达：

在thp-1细胞经两种肽刺激24和48小时后，收集细胞，流式技术检测细胞表面cd86和hla-dr分子的表达。

在24和48小时刺激后，cd86分子的表达无显著变化，见图17。

而hla-dr分子在刺激24小时后，α1在40、80μg/ml浓度时均显著，分别达到32.26±4.28、42.6±5.64pg/ml；α2在5、10、80μg/ml浓度时均显著，达到38.51±4.29、38.78±6.48、41.4±2.46pg/ml；t5在10、20μg/ml浓度时显著，达到35.3±5.18、41.53±2.36pg/ml。α2在各浓度该分子的表达均显著增加，但在48小时均无明显改变，见图18。

讨论

1.该研究是以双盲的研究方法，研究α1、α2多肽对免疫细胞功能的影响。作为初筛实验，我们选用健康人的外周血单个核细胞和人巨噬细胞株thp-1为研究对象，以不同浓度刺激两类细胞。研究α1、α2多肽对单个核细胞中淋巴细胞亚群分化、产生细胞因子的种类变化，分析α1、α2多肽对thp-1细胞株表面分子表达和细胞因子产生种类。最终结果显示α1、α2两种肽能刺激健康人外周血单个核细胞产生促炎因子(il-6、il-1β和tnf-α)和抗炎因子(il-10)，且与pha共同作用时能促进促炎因子(il-6、il-4和il-17a和il-1β)的表达。同时能促进thp-1细胞株hlaii分子的表达。这些结果说明，两种肽可能以某种机制调节者免疫细胞的激活，对炎症反应有一定的调节作用，但具体机制有待于进一步研究。

2.该研究结果显示出α1、α2多肽对单个核细胞有激活作用，对thp-1细胞有促进提呈的作用。但机制还不清楚。

六.三种多肽β1、β2、β3和对照t5免疫活性检测结果及结果分析

本文在体外研究三种肽对人巨噬细胞株thp-1和外周血单个核细胞中的t细胞表面分子的表达以及激活作用的影响，评价其对免疫细胞的作用效果。结果显示，三种肽中只有β1刺激外周血单个核细胞产生il-17a，无论单独作用还是与pha共同作用，但只在10μg/ml的浓度时单独刺激这些细胞与对照组相比有显著差异，在20μg/ml浓度时与pha共同作用有显著差异。另外，在与pha共同作用时，还能促进il-6的产生，在40、80μg/ml的浓度作用有显著差异。β1还能促进thp-1细胞产生il-1β，以40、80μg/ml浓度作用最为明显。这些结果表明β1能促进巨噬细胞产生促炎因子il-1β，并促进t细胞产生il-17a和il-6。提示β1对免疫细胞具有一定的促炎作用，而对两类细胞的分化没有影响。其它两种肽对两类细胞均无明显作用。

三种肽β1、β2、β3和对照t5作用于外周血单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞等细胞之后的细胞因子的表达变化

1.三种肽β1、β2、β3作用于外周血单个核细胞后的细胞因子的表达变化

三种肽β1、β2、β3单独作用于外周血单个核细胞后，除il-4、il-10未检出的细胞因子外，其余被检测的细胞因子il-17a、ifn-γ、tnf-α、il-2、il-6在48h均被检测出。

与对照组7.54±0.15pg/ml相比，只有il-17a经β1刺激48小时后的产生量稍有增加，但只有10μg/ml的浓度下有显著差异，表达量为11.68±1.58pg/ml。结果见图19-图23。

2.三种肽β1、β2、β3与pha同时作用于外周血单个核细胞后产生的细胞因子特点：

三种肽β1、β2、β3与pha同时作用于单个核细胞48后，均检测出细胞因子。

只有β1能刺激il-17a的产生，但经统计学分析只在20μg/ml浓度时与pha组比较有显著差异，表达量为17.47±6.26pg/ml，见图24。

il-6的产生在β1各浓度均高于pha组0.9±0.2pg/ml，只在40、80μg/ml浓度时显著高于对照组，il-6表达量为2.3±0.3pg/ml、6.5±1.3pg/ml，见图8。其它细胞因子无显著变化，见图26-图30。

3.三种肽β1、β2、β3单独或与pha共同作用于外周血单个核细胞cd4、cd8细胞亚群的变化：

用流式技术仪检测经三种肽β1、β2、β3作用的单个核细胞cd3+t细胞中cd4+t和cd8+t细胞的百分含量，见图31、图32。与空白对照组相比，无显著差异，说明三种肽β1、β2、β3对单个核细胞中两个细胞亚群的总量和分化无显著影响，即它们在体外不能促进cd4和cd8细胞亚群的分化。肽与pha共同作用于单个核细胞后，尽管百分比有变化，但与对照组相比，均无显著差异。

4.三种肽β1、β2、β3作用于thp-1细胞的结果

4.1.thp-1细胞经三种肽β1、β2、β3刺激24小时后细胞因子的表达：

thp-1细胞经三种肽β1、β2、β3刺激24小时后，收集上清，elisa法检测上清中il-12p70、il-1β和tnf-α的表达，结果显示il-12p70未检测出，il-1β和tnf-α均检测出。

见图33，只有β1对il-1β的产生有影响，且在40μg/ml的浓度时，表达量为23.9±2.6pg/ml与pha组12.1±0.7pg/ml相比有显著差异；在80μg/ml的浓度时，表达量为36.2±2.6pg/ml与pha组相比有极显著差异。

4.2.thp-1细胞表面分子的表达：

在thp-1细胞经三种肽β1、β2、β3刺激24h后，收集细胞，流式技术检测细胞表面cd86和hlaii类分子的表达。结果如图35-图36。在刺激后，cd86和hlaii类分子的表达与对照组相比均无显著变化。说明三种肽对巨噬细胞的提呈功能无影响。

讨论

该研究是以双盲的研究方法，研究β1、β2和β3对免疫细胞功能的影响。我们选用健康人的外周血单个核细胞和人巨噬细胞株thp-1为研究对象，以不同浓度刺激两类细胞。研究β1、β2和β3对单个核细胞中淋巴细胞亚群分化、产生细胞因子的种类变化，分析β1、β2和β3对thp-1细胞株表面分子表达和细胞因子产生种类。最终结果显示，β1、β2和β3均能刺激健康人外周血单个核细胞产生细胞因子。

β1能刺激健康人外周血单个核细胞产生细胞因子il-17a，且与pha共同作用时更为明显；另外，此肽在与pha共同作用时也能促进il-6的产生。同时能促进thp-1细胞株产生il-1β。这些结果说明，β1可能以某种机制激活巨噬细胞，具有促进炎症反应的作用。

以上所述仅是本发明的具体实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以具体实施例公开如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述公开的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110>神威药业集团有限公司

<120>源于血红蛋白的免疫活性人胎盘多肽

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